c-Met基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其稳定转染细胞株的筛选

摘要

在我国结直肠癌的发病率居所有恶性肿瘤第三位。主要死因为血性及淋巴转移，约30-40％的患者在确诊时已发生转移。常见转移部位有区域淋巴结，肝脏，肺及腹膜，其中以肝脏最为常见，因此抑制转移将成为结直肠癌的有效治疗方法。研究发现HGF/c-Met信号通路与结直肠癌肝转移密切相关。肝细胞生长因子HGF又称离散因子(scatter factor，SF)，其受体为c-Met，两者结合后可激活多条下游信号通路，具有强促有丝分裂、组织器官成形、诱导上皮细胞迁移、侵袭以及诱导血管生成等作用。在一些恶性肿瘤组织中包括结直肠癌在内，c-Met基因存在突变、过表达，而且与肿瘤发生、发展、转移及患者预后有密切关系。有研究表明，合并肝转移的结直肠癌患者中c-Met拷贝数存在以下关系：肝转移灶>正常肝组织，肝转移灶>原发灶，而且HGF含量较无肝转移的患者高。因此，HGF/c-Met极有可能成为结直肠癌，尤其是合并肝转移的结直肠癌新的治疗靶点。
　　 小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)作为与RNA干扰现象紧密相连的非编码RNA之一，是后基因组时代的重要研究工具。其作用机制是：进入体内的siRNA双链解开，引导链(指siRNA反义链，antisense siRNA)进入RNA介导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，并切断具有序列特异性的靶标mRNA，切断部位大约在与反义小干扰RNA配对序列的中部，然后靶标mRNA降解。
　　 我们在前期实验中已经证明HGF可以促进人结肠癌细胞SW620的增殖和移行，并呈质量浓度依赖性。本实验采用RNAi方法抑制HGF受体c-Met基因表达，进一步探讨HGF/c-Met信号通路对人结肠癌细胞株SW620的增殖和移行的影响，以期寻找治疗结直肠癌的新方法。
　　 目的：筛选结肠癌细胞c-Met特异性siRNA并构建其慢病毒载体；包装病毒并筛选稳定下调c-Met的SW620细胞系。
　　 方法：
　　 1.设计3条针对c-Met基因的siRNA序列，将其克隆入慢病毒载体pSD31中，用LipofectamineTM2000介导，将载有c-Met基因特异性的siRNA序列的慢病毒质粒转染入人结肠癌细胞株SW620，同时设立空白对照。
　　 2.用Western Blot，RT-PCR方法检测细胞中c-Met蛋白和mRNA表达改变情况。
　　 3.选择沉默效率最高的序列，用LipofectamineTM2000介导，将pRSV，pMDG，pMDLg-pRRE及连有目的片段的慢病毒载体共转染293T细胞进行病毒包装，转染SW620细胞，用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定细胞株。
　　 4.倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化。
　　 结果：
　　 1.通过酶切及公司测序等方法验证构建慢病毒载体的正确性，成功构建慢病毒载体pSD31-met并将其转染入人结肠癌细胞株SW620中。
　　 2.采用Western Blot，RT-PCR方法检测转染pSD31-met后SW620细胞中c-Met的mRNA和蛋白表达均较对照组显著降低。
　　 3.用嘌呤霉素( puromycin)筛选出稳定细胞株，PCR检测携带目的片段的病毒基因整合到宿主细胞基因组中，Western Blot检测c-Met蛋白表达下降。
　　 4.倒置显微镜下观察发现，在转染后48小时，转染pSD31-met组，细胞增殖明显减少，细胞数量减少，细胞聚集情况明显抑制。
　　 结论：
　　 1.不同的siRNA对人结肠癌细胞c-Met基因的表达抑制效能不同。
　　 2.能够构建出有干扰效能的c-Met siRNA慢病毒载体。
　　 3.成功包装出慢病毒并筛选出稳定转染细胞。

目录

文摘

英文文摘

c-Met基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其稳定转染细胞株的筛选

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 酪氨酸激酶受体c-Met及其信号途径与肿瘤的发展与治疗

参考文献

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