脂质体包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN的非特异性聚集与鸟嘌呤含量及启动子位置关系的动物实验研究

摘要

目的:制备2种鸟嘌呤(Guanine G)含量及2种离启动子位置远近不同的脂质体包裹99Tcm-HYNIC(联肼尼克酰胺)-survivin(生存素)ASODN(antisense oligodeoxynucleotide,反义寡脱氧核苷酸),用制备好的4种反义寡脱氧核苷酸显像探针对荷人肝癌(SMMC-7721)裸鼠进行显像及体内生物学分布研究,分析ASODN与启动子相对位置及其G含量对非特异性聚集的影响,以寻找最佳反义显像碱基序列,提高反义显像质量。
　　 方法:
　　 1：肿瘤模型制备:瘤细胞接种:SMMC-7721肝癌细胞经细胞传代培养后,取处于对数生长期的细胞0.2ml(含细胞数约为0.7×107个),在无菌条件下接种于健康BALB/C裸小鼠右髂窝皮下,并在SPF(specific pathogenfree,无特异病原体)环境继续饲养约6～8周后,待肿瘤生长至0.8～1.0cm时进行实验分组。
　　 2：脂质体包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN的制备:制备两种G含量相同而离启动子远、近不同10个碱基单链ASODN和两种G含量不同而离启动子位置相近16个碱基单链ASODN,前者两端均3个磷酸基硫代修饰,后者两端均5个磷酸基硫代修饰,四种ASODN均5'-末端氨基修饰,偶联HYNIC后用99Tcm标记,然后用Cellufine Mini-Column(内装有Chisso纤维素基凝胶填料CellufineGH-25,分子量＞3kD的物质可被滤出)纯化经ZD-600099Tcm分析仪,测定收集放射峰管,然后脂质体包裹备用。
　　 3：脂质体包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN的质量鉴定:用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)及快速硅胶纸层析法和聚酰胺凝胶薄膜法测定标记物即刻标记率及放化纯。并测定标记物分别与生理盐水及人新鲜血清37℃保温6h后的标记率,评价标记物的稳定性。
　　 4：分组显像及生物学分布:将20只荷瘤小鼠随机分为四组,分别注射不同的显像剂A1、A2、A'1、A'2,每组5只,分别经尾静脉注入相应的脂质体包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN,每只分别注射含37MBq(1mCi)/0.2ml显像剂,进行显像和体内生物分布研究。注射后2h和4h仰卧在针孔型准直器下用SPECT(single photon emission computedtomography,单光子发射型计算机体层摄影)仪进行静态核素显像,在采集的平面图像上,以相同大小感兴趣区(ROI,region of interest)获取肿瘤部位(T,tumor)和对侧肢体相应部位的放射性计数(NT,non-tumor),计算2h和4h时NT/T(non-tumor to tumor)放射性比值。4h显像结束后立即眼球取血,脱颈处死,迅速分离其肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、骨、对侧肢体肌肉等脏器、组织,生理盐水洗涤后粘干、称重,置于试管中用γ井型探测仪测量各器官或组织的放射性计数及同时刻标准源的放射性计数,计算每克组织中放射性计数占标准源总放射性计数的比值(％ID/g),计算4h时肌肉组织与肿瘤组织的％ID/g比值(muscle to tumor,M/T),即NT/T比值,并进行统计学分析。
　　 5：病理学检查:各组中随机选取荷人肝癌(SMMC-7721)裸鼠瘤体的切块,用4％多聚甲醛固定,48小时后,石蜡包埋,行常规HE染色。
　　 结果:
　　 1：裸鼠移植瘤模型的观察与鉴定:
　　 20只裸鼠均接种成功,成瘤率100％。肉眼观察可见肿块呈肉红色,结节状,表面光滑,质硬,切面呈灰白色。HE染色细胞着色不均匀,呈上皮样状态,卵圆形,多边形,星形等不规则形态,核分裂像多见,核浆比例失调倒置,核异型性明显,符合肿瘤特点。
　　 2：脂质体包裹99Tcm-HYNIC-survivinASODN的质量鉴定结果:
　　 HPLC检测99Tcm-HYNIC-survivinASODN呈单峰,保留时间约为18min,与survivinASODN紫外峰保留时间相吻合。结合快速硅胶纸层析法及聚丙酰胺凝胶薄膜层析法综合测得的99Tcm-HYNIC-survivinASODN的即刻标记率为70％±0.69％(n=5)。经Cellufine Mini-Column纯化后放射性化学纯度约为95％±1.29％(n=5)。与生理盐水及人新鲜血清37℃保温6h后测定标记率分别约为66％、65％,放化纯为93％、90％左右,二者变化不明显,说明此标记物血清蛋白结合率低,稳定性好。
　　 3：显像及生物学分布结果:
　　 显像情况:注射显像剂2h时荷瘤小鼠腹部放射性核素浓聚明显,肝脏和双肾显影清晰,胸部放射性核素浓聚稍淡,四肢和头部核素分布稀疏,右髂窝肿瘤部位显影清晰,随着时间延长,周围组织本底逐渐降低,右髂窝肿瘤部位核素逐渐增浓,4h时达高峰。
　　 生物学分布:四种99Tcm-HYNIC-survivinASODN都是肝、肾％ID/g值较高,说明都是通过肝脏代谢,肾脏排泄,因此腹部本底较高。
　　 四种显像剂显像及分布结果比较:NT/T值A1、A2分别为0.243±0.005和0.405±0.007(2h);0.204±0.004和0.267±0.007(4h);A'1、A'2分别为0.256±0.004和0.479±0.015(2h);0.227±0.004 and0.360±0.013(4h)。体内分布:A1、A2、A'1、A'2 NT/T分别为0.173±0.035,0.315±0.059,0.293±0.049,0.430±0.021(4h)。经统计学分析后得出,A1、A2在荷瘤鼠中显像的NT/T值比较在2h和4h均有显著性差异(2h时t=40.425,p=0.000＜0.01;4h时t=16.760,p=0.000＜0.01);A'1、A'2在荷瘤鼠中显像的NT/T值比较在2h和4h也均有显著性差异(2h时t=31.194,p=0.000＜0.01;4h时t=22.356,p=0.000＜0.01)。A1、A2在荷瘤鼠中4h生物分布的NT/T值比较差异有统计学意义(t=3.622,p=0.022＜0.05);A'1、A'2在荷瘤鼠中4h生物分布的NT/T值比较差异也有统计学意义(t=4.403,p=0.012＜0.05.)。
　　 结论:
　　 研究表明:G含量相同,离启动子位置较近的反义显像碱基序列,非特异性聚集率较低,显像质量较好;启动子位置相近,G含量低的反义显像碱基序列,非特异性聚集率较低,显像质量较好。

目录

文摘

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前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 消化系统肿瘤中Survivin的表达及靶向诊断的研究进展

致谢

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