泛素特异性蛋白酶Usp46和Usp26基因错义突变对去泛素化酶活性的影响及其流行病学意义

摘要

泛素-蛋白酶体通路(Ubiquitinproteasomepathway)通过特异性地降解细胞内的蛋白质来调控多种细胞进程，包括细胞周期、免疫反应、肿瘤生长和炎症等。该通路由泛素、泛素化酶（包括泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3）、蛋白酶体和去泛素化酶组成。泛素化酶给底物蛋白加上泛素标签，泛素化的蛋白质被运送到蛋白酶体降解。正如磷酸化和去磷酸化一样，蛋白质的泛素化也是一个可逆的过程，去泛素化酶通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命。
　　 尽管在决定蛋白质寿命方面，泛素化与去泛素化同等重要，但对去泛素化酶的研究远落后于泛素化酶。近年来，去泛素化酶是多种神经精神性疾病的致病基因（包括UCH-L1与帕金森病;USP14与脊髓小脑共济失调等），以及USP7抑癌基因功能的发现，使去泛素化酶的研究开始引人注目。
　　 Usp46和Usp6均属于人类基因组编码的泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin-specificprotease)，是去泛素化酶的亚家族，二者的生理功能至今仍所知甚少。
　　 Usp46位于4号染色体长臂双向性情感障碍基因座上(4q12)，编码366个氨基酸。2009年Tomida等在NatGenet上报道了Usp46是调控小鼠“行为绝望”的数量基因，发现Usp46△K92突变小鼠在悬尾试验(TailSuspensionTest)和强迫游泳试验(ForcedSwimmingTest)中几乎没有不动时间。进一步对其机制进行研究的结果表明，Usp46的第92号赖氨酸的缺失导致了GABA系统异常是主要原因，提示Usp46参与调控GABA系统，然而调控机制不明。本研究采用去泛素化酶活性检测系统来深入探讨第92号赖氨酸的缺失对USP46酶活性的影响，以及人群中Usp46错义突变对酶活性的影响及其与ADHD的关联，为研究Usp46错义突变与精神性疾病间的关联奠定基础。
　　 Usp26定位于Xq26.2，被认为是与男性不育症相关的候选基因，然而各研究的结果并不一致。本研究的目的是采用去泛素化酶活性检测系统和meta分析的方法来研究这些错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响，深入探讨Usp26基因错义突变与男性不育症的相关性。
　　 第一部分:泛素特异性蛋白酶Usp46基因错义突变对去泛素化酶活性的影响及其在健康人群和ADHD患者中的分布情况
　　 目的:
　　 去泛素化酶通过负向调节泛素-蛋白酶体通路影响细胞内蛋白质的寿命，参与调节多种细胞进程，其异常与多种疾病相关。2009年Tomida等报道去泛素化酶Usp46是调控小鼠“行为绝望”的数量基因，Usp46第92号赖氨酸缺失(△K92)导致了GABA系统异常，是造成突变小鼠在悬尾试验和强迫游泳试验中几乎没有不动时间的主要原因。
　　 Usp46引起GABA系统异常的分子机制并不十分清楚。本研究采用去泛素化酶活性检测系统检测第92号赖氨酸的缺失对USP46酶活性的影响，为研究Usp46调控GABA系统的分子机制提供新的思路。并且，通过检测人群中Usp46V96I错义突变对酶活性的影响，建立V96I突变的基因分型方法，检测V96I错义突变在健康人群及注意缺陷多动障碍（ADHD）患者中的分布情况，为研究Usp46错义突变与精神性疾病间的关联奠定基础。
　　 方法:
　　 1.pGEX-Usp46(△K92)及pGEX-Usp46(V96I)突变质粒构建。分别以本室保存的大鼠pGEX-Usp46及人的pGEX-Usp46野生型质粒为模板，利用定点突变的方法构建pGEX-Usp46(△K92)及pGEX-Usp46(V96I)突变型。对突变产物进行限制性内切酶酶切和测序鉴定。
　　 2.pAC-T7-Usp46(△K92)及pAC-T7-Usp46(V96I)突变质粒构建。从构建的pGEX-Usp46各突变质粒酶切出Usp46基因目的片段，连入pAC-T7质粒的BamHI酶切位点中来构建pAC-T7-Usp46(△K92)及pGEX-Usp46(V96I)突变质粒，并进行酶切鉴定。
　　 3.采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物对Usp46(△K92)突变和Usp46(V96I)突变进行去泛素化酶活性分析，Odyssey双色红外激光成像系统扫描。
　　 4.Usp46(V96I)突变的基因分型方法的建立及在健康人群和ADHD患者中的检测。收集健康人群和ADHD患病儿童的血液样本，提取基因组DNA，以Genbank参考序列为基础，设计V96I位点特异性扩增引物，以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增并测序分型。
　　 结果:
　　 1.大鼠Usp46第92号赖氨酸缺失对酶活性的影响
　　 测序结果证实成功将大鼠92号赖氨酸去除，构建了pGEX-Usp46(△K92)质粒，以及pAC-T7-Usp46(△K92)突变质粒。
　　 USP46(△K92)突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36KDa的蛋白产物，相对定量结果显示△K92突变使USP46去泛素化酶活性下降为27.04％±7.50％，采用Ub-Met-β-gal模型底物检测的结果与之相似，Usp46△K92突变活性下降为42.78％±6.47％，因此采用此两种检测系统均显示USP49的第92号赖氨酸缺失使USP46去泛素化酶活性显著下降，提示Usp46突变引起的小鼠“行为绝望”表型与酶活性密切相关。
　　 2.人类Usp46基因错义突变V96I对酶活性的影响
　　 测序结果证实人类Usp46第96号氨基酸成功由缬氨酸突变为异亮氨酸，构建了pGEX-Usp46(V96I)质粒，以及pAC-T7-Usp46(V96I)突变质粒。
　　 USP46(V96I)突变与USP46野生型相似，能够将模型底物GST-Ub52切断，产生大小约为36KDa的蛋白产物，相对定量结果显示V96I突变使USP46去泛素化酶活性下降为38.51％±1.40％，采用Ub-Met-β-gal模型底物检测的结果一致，USP46(△K92)突变活性下降为50.79％±2.60％。因此采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物检测活性均显示V96I突变后USP46的去泛素化酶活性显著下降。
　　 3.人群中Usp46(V96I)突变的基因分型方法的建立及其在ADHD和健康人群中的检测
　　 共收集100例ADHD患病儿童（男性53例，女性47例），健康人群122份血液标本，提取基因组DNA纯度较好，以V96I位点特异性扩增引物成功扩增出200bp左右的特异DNA条带，测序结果显示ADHD患者和健康人群标本中均不存在V96I突变，此分型方法具有较好的稳定性和可靠性。
　　 结论:
　　 本研究采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物活性检测系统发现Usp46第92号赖氨酸缺失后，其去泛素化酶活性分别下降了72.96％和57.22％，为研究抑郁症等精神性疾病的分子机制提供了新的线索。
　　 人类Usp46V96I错义突变与△K92类似，使USP46去泛素化酶活性显著下降，建立了V96I基因分型的方法，在ADHD患者和健康人群标本中未检测到V96I突变，提示该突变可能不是ADHD的主要致病因素，该方法的建立为进一步开展Usp46错义突变与精神性疾病的关联性研究奠定了基础。
　　 第二部分:370-371insACA，494T＞C，1423C＞T,1090C＞T和1737G＞A错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响
　　 目的:
　　 Usp26基因同Usp46基因一样，也属于泛素特异性蛋白酶，近来多个研究发现Usp26基因5个常见的基因突变370-371insACA，494T＞C，1423C＞T、1090C＞T和1737G＞A可能与男性不育症相关，但研究结果不一致，尤其是基因错义突变是否引起蛋白的功能改变至今尚无报道。本部分为进一步探索此5个错义突变对USP26蛋白功能的影响，构建Usp26突变质粒，采用去泛素化酶活性检测体系检测突变对酶活性的影响，为进一步探索USP26的生理功能及其在不育症中的作用提供线索。
　　 方法:
　　 1.pGEX-Usp26突变质粒构建。以本室保存的pGEX-Usp26为模板，利用定点突变的方法构建5个错义突变，370-371insACA，494T＞C，1423C＞T、1090C＞T和1737G＞A突变型。由于370-371insACA，494T＞C，1423C＞T常为连锁存在，因此常被统称为cluster单倍体突变。为研究cluster单倍体突变对活性的影响，在pGEX-Usp26(370-371insACA)突变质粒的基础上再进行494T＞C和1423C＞T定点突变，对突变产物进行限制性内切酶酶切和测序鉴定。
　　 2.pAC-T7-Usp26突变质粒构建。从构建的pGEX-Usp26各突变质粒BamHI酶切位点切出Usp26基因目的片段，连入pAC-T7质粒的BamHI酶切位点中以构建pAC-T7-Usp26各突变质粒，并进行酶切鉴定。
　　 3.采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物对各突变进行去泛素化酶活性分析，Odyssey双色红外激光成像系统扫描。
　　 结果:
　　 1.突变质粒构建:测序结果证实370-371insACA突变引起T123-Q124ins氨基酸改变，494T＞C突变引起L165S氨基酸改变，1423C＞T突变引起H475Y氨基酸改变，1090C＞T突变引起L364F氨基酸改变，1737G＞A突变引起M579I氨基酸改变，以及cluster单倍体突变引起T123-Q124ins、L165S、H475Y氨基酸改变，构建了pGEX-Usp26各突变质粒，以及pAC-T7-Usp26各突变质粒。
　　 2.370-371insACA,494T＞C,1423C＞T,1090C＞T和1737G＞A突变对酶活性的影响:这五种突变与Usp26野生型对模型底物GST-Ub52的作用相同，均去泛素化GST-Ub52，产生分子量约36KDa的产物。Ub-Met-β-gal模型底物去泛素化酶活性分析的结果与GST-Ub52法一致，突变不影响USP26的去泛素化酶活性。
　　 3.Cluster单倍体突变对酶活性的影响:USP26(cluster)突变去泛素化GST-Ub52，产生分子量约36KDa的产物，与野生型USP26的作用一样。Ub-Met-β-gal模型底物去泛素化酶活性分析的结果与GST-Ub52法一致，说明cluster单倍体突变不影响USP26的去泛素化酶活性。
　　 结论:
　　 本部分的结果表明Usp26基因370-371insACA，494T＞C，1423C＞T,1090C＞T和1737G＞A及cluster单倍体型错义突变均不影响USP26的去泛素化酶活性，为探索USP26的生理功能及其在不育症中的作用提供了新的线索。
　　 第三部分:Usp26基因cluster、1090C＞T和1737G＞A错义突变与男性不育症相关性的Meta分析
　　 目的:
　　 男性不育症是世界性的难题，据统计，全世界育龄夫妇中不孕不育症的发病率约为15％，其中男性不育约占50％。
　　 男性不育症病因复杂，除了内分泌、感染、生殖器畸形、免疫等原因外，遗传因素越来越受到人们重视，已确定与男性不育症有关的遗传因素包括染色体异常、Y染色体微缺失等基因变化，近年来研究发现X染色体上的基因变异也可能与男性不育有关，如雄激素受体基因多态性可能导致畸精子症等。
　　 近来有多个研究发现泛素特异性蛋白酶Usp26基因370-371insACA，494T＞C，1423C＞T、1090C＞T和1737G＞A5个常见的基因突变可能与男性不育症相关，然而各研究的结果不一致。370-371insACA，494T＞C，1423C＞T常为连锁存在，因此常被统称为cluster突变。在本研究第二部分发现无论是5个基因突变单个存在还是以cluster单倍体突变，均未影响USP26蛋白的去泛素化酶活性，本研究部分采用meta分析的方法，综合评价Usp26基因cluster、1090C＞T和1737G＞A基因突变与男性不育症的关联强度，为研究Usp26基因在男性不育症发病中的作用奠定基础。
　　 方法:
　　 文献检索:以检索词“ubiquitinspecificprotease26/Usp26”、“maleinfertility”、“泛素特异性蛋白酶26”和“男性不育”等联合检索PubMed数据库、HuGNet数据库和中文学术期刊全文数据库(ChineseNationalKnowledgeInfrastructure，CNKI)，检索截止日期2012年9月30日，无语种限制。
　　 文献选择:纳入研究Usp26基因5个常见的基因突变(370-371insACA，494T＞C，1423C＞T，1090C＞Tand1737G＞A)与男性不育症关联性的病例-对照研究，提取数据。
　　 统计分析:采用Stata11.0软件进行数据分析，应用固定效应模型和随机效应模型估计合并后的OR值(OddsRatio，OR)和95％可信区间值(95％ConfidentialInterval，95％CI)来评价关联强度，对合并后的效应值OR进行显著性检验，绘制森林图。异质性检验采用Cochran'sQtest和I2值。采用亚组分析、敏感性分析分析异质性的来源，用漏斗图和Harbord检验评估小规模研究的效应，检验发表偏倚。
　　 结果:
　　 符合本研究纳入标准的文献共9篇，累计男性不育症患者1675例和对照2547例，其中2篇文献的研究对象是亚洲人群，6篇是高加索人群，1篇既有亚洲人群又有高加索人群。
　　 1)Cluster基因突变:
　　 有关cluster基因突变与男性不育症相关性的文献共纳入7篇，累计患者1297例和对照2293例。Cochran'sQtest的结果显示P值为0.29，I2为17.2％，提示可能存在轻度异质性。随机效应模型结果显示，合并OR值为1.55，95％CI:0.82-2.93，表明cluster基因突变与男性不育症间的关联无统计学意义。
　　 依据人种进行的亚组分析，固定效应模型的结果显示高加索人群中合并OR值为1.625，95％CI:0.664-3.977;亚洲人群中的合并OR值为2.252，95％CI:0.865-5.865，提示无论是在高加索人群还是亚洲人群中cluster基因突变与男性不育症的关联无统计学意义。
　　 按发表年份进行累积meta分析，显示随着年份的增加cluster基因突变与男性不育症的发病呈现出无关联的趋势。敏感性分析显示，逐个剔除研究后关联不受单个研究的影响，说明了结果的可靠性。
　　 漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P＞0.05，不存在小规模研究效应，无发表偏倚。
　　 无精子症和少精子症与cluster突变关联性研究的meta分析表明，cluster基因突变与无精子症的关联无统计学意义，随机效应模型显示合并OR值为2.039，95％CI:0.955-4.357。cluster基因突变与少精子症的的关联无统计学意义，随机效应模型显示合并OR值为0.896，95％CI:0.252-3.186。
　　 对照组中cluster的突变频率meta分析表明，异质性检验结果为P=0.018(＜0.10)，I2为53.4％，表明研究间存在高度异质性，不适合计算对照组的合并突变率。依对照人群的特征分为精液参数正常组、已生育组、生育情况未知组进行亚组分析，随机效应模型的结果显示三个对照组中精液参数正常组的合并突变率最低为2.15％(95％CI:0.81％-5.61％)，而生育情况未知组的合并突变率最高为3.69％(95％CI:0.70％-17.34％)。依据对照不同，将患者分别与精液参数正常组、已生育组、生育情况未知组三个对照组进行meta分析，随机效应模型结果显示合并OR值(95％CI)分别为1.876(0.812-4.333)，1.481(0.613-3.579)和1.597(0.230-11.097)
　　 2)1090C＞T基因突变:
　　 有关1090C＞T基因突变与男性不育症相关性的文献共纳入4篇，累计患者866例和对照558例。采用随机效应模型合并数据，合并OR值为1.598，95％CI:0.933-2.735，Cochran'sQtest的结果显示P值为0.49，I2为0，提示不存在统计学上的异质性。表明1090C＞T基因突变与男性不育症间的关联无统计学意义。
　　 累积meta分析显示随着年份的增加cluster基因突变与男性不育症的发病呈现出无关联的趋势。敏感性分析显示结果可靠，逐个剔除研究后关联受单个研究的影响较小。
　　 漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P＞0.05，不存在小规模研究效应，无发表偏倚。
　　 3)1737G＞A基因突变
　　 有关1737G＞A基因突变与男性不育症相关性的文献纳入3篇，累计患者688例和对照504例。异质性检验Cochran'sQtest的结果显示P值为0.229，I2为32.2％，提示可能存在中等程度的异质性。随机效应模型合并OR值为2.641，95％CI:0.969-7.194。
　　 累积meta分析和敏感性分析结果显示，Lee等的研究对研究结果影响较大。采用漏斗图示意发表偏倚的情况，纳入的文献完整地出现在图上，漏斗图基本对称，Harbord检验结果显示P＞0.05，说明不存在小规模研究效应，无偏倚情况。由于此位点纳入文献较少，因此其结论还有待于进一步的研究证实。
　　 结论:
　　 Meta分析的结果表明尚不能认为泛素特异性蛋白酶Usp26基因cluster、1090C＞T和1737G＞A基因突变与男性不育症的发病相关。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 泛素特异性蛋白酶Usp46基因错义突变对去泛素化酶活性的影响及其在健康人群和ADHD患者中的分布情况

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 370-371 ins ACA，494 T>C，1423 C>T，1090 C>T和1737 G>A错义突变对USP26去泛素化酶活性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 Usp26基因cluster、1090 C>T和1737 G>A错义突变与男性不育症相关性的Meta分析

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述

致谢

个人简历