8-异前列腺素F2α和p22phox C242T基因多态生与2型糖尿病肾病患者的相关性研究

摘要

目的:糖尿病肾病(Diabeticnephropathy，DN)是糖尿病的主要慢性微血管并发症之一，也是导致终末期肾功能衰竭的重要原因，肾小球基底膜增厚和细胞外基质的积聚是DN的主要病理学特征。Ceriello等提出氧化应激（Oxidativestress，OS）是参与糖尿病及其并发症的关键环节[1]，而NADPH氧化酶是机体产生氧自由基(Reactiveoxygenspecies，ROS)的关键酶，其中亚基p22phox对NADPH氧化酶产生ROS发挥关键作用，并且p22phox基因第242位的C突变为T可导致NADPH氧化酶活性的改变[2]。8-异前列腺素F2α(8-iso-prostaglandinF2α，8-iso-PGF2α)是近年来新发现的异前列腺素类代谢产物，被认为是评价机体氧化应激的理想指标[3-5]。因此本研究采用酶联免疫吸附(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)法检测8-iso-PGF2α从而明确氧化应激在DN中的作用;通过检测DN患者NADPH氧化酶p22phox亚基242位点的基因分布，探讨该基因多态性与DN的关系。
　　方法:试验组为选取本院内分泌科住院的2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)患者206例，其中男125例，女81例，年龄为（55.45±11.69）岁，均符合1999年WHO糖尿病诊断和分型标准，为河北地区汉族人，彼此间无亲缘关系。入选者均排除其它内分泌疾病、恶性肿瘤、泌尿系感染、其他原因引起的肾脏疾病，无冠心病、心功能不全、炎症和慢性肝脏疾病，亦无糖尿病急性并发症。根据尿微量白蛋白与肌酐比值（男＞2.5mg/mmol，女＞3.5mg/mmol）将患者分为两组:①单纯糖尿病(Simplediabetes，SDM)组102例，男61例,女41例，年龄(54.22±10.42)岁;②DN组104例，男64例，女40例，年龄（56.65±12.76）岁。
　　正常对照(Normalcontrol，NC)组为同期我院医务人员及常规体检者100例，其中男63例，女37例，年龄（52.8±11.4）岁，河北汉族人，无亲缘关系，均无糖尿病、高血压、心脑肾等疾病史。正常对照组和试验组性别与年龄匹配。
　　(1)临床资料收集:包括性别、年龄、糖尿病病程、身高、体重等，计算体质量指数(Bodymassindex，BMI);测量并记录血压。
　　(2)血生化指标检查:入试者均隔夜空腹8-12小时后于次日晨起抽取静脉血，使用全自动生化仪测定空腹血糖(Fastingplasmaglucose，FBG)、总胆固醇(Totalcholesterol，TC)、甘油三酯(Triglycerides，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High-densitylipoproteincholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇（Low-densitylipoproteincholesterol，LDL-C）;
　　(3)放射免疫法γ计算器检测空腹胰岛素(Fastinginsulin，FINS)并计算胰岛素抵抗指数[HOME-IR=FINS(mU/L)×FPG(mmol/L)/22.5];
　　(4)免疫比浊法测定糖化血红蛋白(HbA1c)与尿微量白蛋白比肌酐(尿A/Cr);
　　(5)酶联免疫吸附法（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELASA）测定血清中8-iso-PGF2α水平。
　　(6)基因多态性的测定:①提取DNA:2％乙二胺乙酸(EDTA)抗凝血3ml，血液基因组DNA小量提取试剂盒提取白细胞DNA，紫光分光光度仪测定DNA浓度及纯度。②聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerasechainreaction-Restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)法检测p22phox基因型:以外周血白细胞DNA为模板进行PCR扩增，上下游引物序列分别为:5'-GTGAGTCTCCTCCTGCTCTGG-GGT-3'、5'-GCTTGTTTCGGTCCTGGGTGTTCT-3'，反应体系25ul，其中含12.5ulPCRPremix，8.5ul灭菌双蒸馏水，上下游引物各1ul，模板DNA2ul。在PCR循环仪中94℃预变性5分钟;并按下列程序循环35次，即94℃预变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟;末次循环后，72℃延伸7分钟，然后用限制性内切酶RsaⅠ进行酶解消化，最后对其产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带类型判断p22phox基因型。CC基因型:348bp;CT型:160bp、188bp、348bp;TT型:160bp、188bp。
　　统计学处理:应用SPSS20.0统计软件对结果进行统计学处理，计量资料以均值±标准差(s)表示，并检验正态性;组间比较用方差分析;计数资料组间比较用卡方检验;按Hardy-Weinberg平衡法检验样本的群体代表性;Spearman相关分析法分析8-iso-PGF2α浓度与其他因素的相关性;Logistic回归分析法分析T2DM的危险因素。
　　结果:①试验组与正常对照(NC)组性别、年龄构成比无明显差异，有可比性;试验组的SBP、DBP、BMI、FBG、TC、TG、LDL-C、HbA1c均显著高于NC组(P＜0.05)，HDL-C显著低于NC组(P＜0.05);其中糖尿病肾病(DN)组的BMI、FBG、TC、LDL-C、IR均显著高于单纯糖尿病(SDM)组(P＜0.05)，HDL-C则显著降低（P＜0.05）;②试验组血清8-iso-PGF2α水平（41.66±21.64pg/ml）明显高于NC组（27.95±12.69pg/ml）(P＜0.05);DN组8-iso-PGF2α水平（50.13±24.86pg/ml）明显高于SDM组（33.03±13.10pg/ml）和NC组（27.95±12.69pg/ml）(P＜0.05)。③血清8-iso-PGF2α与SBP、DBP、BMI、FBP、TC、TG、LDL-C、HbA1c呈显著正相关(P＜0.05或P＜0.01)与HDL-C呈显著负相关(P＜0.05)。④DN组CT+TT基因型频率明显高于SDM和NC组(23.1％比13.7％、9％，P=0.039);DN组T等位基因频率亦明显高于SDM和NC组（12.5％比6.9％、4.5％，P=0.009）。⑤CT+TT基因型组的HbA1c、IR及8-isoPGF2α均较CC基因型组升高(P＜0.05或P＜0.01)。CT+TT组DN发病率为53.8％，亦高于CC组31.1％(P＜0.05)。⑥Logistic回归分析示:BMI、TG、8-isoPGF2α及IR为DN的独立危险因素。
　　结论:
　　1、T2DM患者体内存在氧化应激，氧化应激可能参与了糖尿病肾病的发生。
　　2、血清中8-iso-PGF2α水平与p22phox基因多态性密切相关，携带T等位基因者血清8-iso-PGF2α水平较高。
　　3、8-iso-PGF2α是DN的独立危险因素，但T等位基因不是DN的独立危险因素。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 研究对象

2 研究方法

3 统计学分析

结果

1 各组之间临床和生化指标及8-iso-PGF2α的比较

2 各组间基因型和等位基因频率分布

3 血清8-iso-PGF2α与其它指标的相关性分析

4 不同基因型间各指标的比较

5 DN的危险因素分析

附图

附表

讨论

1 8-iso-PGF2α在DN中的作用

2 p22phox C242T基因多态性与DN的关系

结论

参考文献

综述 NADPH氧化酶与糖尿病肾病

致谢

个人简历