补肾法、疏肝法对体外培养小鼠卵泡发育过程中卵母细胞GDF-9及其Smads信号通路影响的研究

摘要

目的:针对体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)中妊娠率低、流产率高等问题，在前期研究证实补肾法、疏肝法具有提高临床妊娠率、改善妊娠结局、提高卵母细胞质量作用的基础上，研究补肾法、疏肝法在小鼠体外卵泡发育过程中对卵母细胞GDF-9及其信号通路的调控作用，以探讨两法改善卵母细胞质量的作用机制，比较两法作用机制及作用环节之异同。
　　方法:含药血清制备:取28只6周龄健康雌性SD大鼠按体重随机分为7组:疏肝低剂量组、疏肝中剂量组、疏肝高剂量组、补肾低剂量组、补肾中剂量组、补肾高剂量组、空白组。实验用逍遥丸为河南宛西制药股份有限公司生产，将48粒逍遥丸溶于100ml蒸馏水中制成混悬液，混悬液含生药0.18g/ml。补肾调经方所需药材一次性购自石家庄市乐仁堂药店，并由本校中药系制成口服液，口服药含生药1.62g/ml。空白对照组每日灌服生理盐水2ml/100g体重;补肾调经方组高、中、低剂量组和疏肝高、中、低剂量组每日灌服补肾调经方和逍遥丸3ml/100g体重、2ml/100g体重、1ml/100g体重（分别相当于成人剂量的18倍、12倍、6倍，每日分两次给药，连续4天。于末次给药后1h大鼠股动脉采血。室温静置2h离心(3000rpm，10min)，取上清，56℃水浴30min灭活补体，0.22μm无菌滤器过滤除菌，得补肾调经方、逍遥丸低、中、高剂量大鼠含药血清和正常大鼠血清，-20℃保存备用。
　　选用出生D12昆明乳鼠432只，分3批进行实验，每批144只，随机分为8组:补肾低剂量组、补肾中剂量组、补肾高剂量组，疏肝低剂量组、疏肝中剂量组、疏肝高剂量组、正常组、空白组，每组18只（3批每组共54只）。
　　分离窦前卵泡:采用机械法分离。将昆明乳鼠颈椎脱臼处死，取出双侧卵巢，用含青、链霉素各200IU/mL的α-MEM培养液清洗1-2次，在带有目镜标尺的体视显微镜下用针头对卵巢进行分离，选择直径在80-120μm之间的窦前卵泡。
　　窦前卵泡培养:35mm培养皿中置2ml培养液，37℃、5％CO2(V/V)、100％湿度培养，24h后卵泡贴壁。分别加入补肾调经方和逍遥丸大鼠含药血清，分为补肾组和疏肝组，补肾含药血清组与疏肝含药血清组分别设置低、中、高三个剂量组，正常大鼠血清为正常组，不加血清为空白组。培养6d，隔天换液1/2;0.25％胶原酶消化窦前卵泡，分离得卵母细胞，第一批置于液氮速冻后-80℃保存备用(用于实时荧光定量PCR)。第二批迅速放入2％多聚甲醛中固定（用于免疫组化）。第三批迅速放入2％多聚甲醛固定（用于免疫荧光）。
　　通过倒置显微镜观察卵泡形态及成活数;采用实时荧光定量PCR检测GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表达;采用免疫组化法、免疫荧光法检测卵母细胞中上述指标蛋白的表达。
　　结果:
　　1卵泡生长过程中形态及结构变化
　　体外培养第2天，窦前卵泡贴壁，固定于培养皿底，不能移动;第4天卵泡颗粒细胞数目明显增多，培养皿底平铺一层细胞;第6天颗粒细胞层数增多，颗粒细胞越过卵泡基底膜生长，卵泡逐渐失去球形的三维结构，转变成为煎蛋样外观。消化卵泡膜细胞及颗粒细胞后，可见卵母细胞。
　　2空白组、正常组、疏肝及补肾各剂量组窦前卵泡成活数的比较
　　在卵泡的体外培养过程中，D2各组卵泡成活数比较，疏肝高剂量组及补肾高剂量组较其它各组成活数均有增高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）;D4各组卵泡成活数比较，疏肝高剂量组、补肾中剂量组及补肾高剂量组较其它各组均有增高趋势，其中补肾高剂量组卵泡成活数较其它各剂量组均增高且有统计学意义（P＜0.05）。在体外培养D6，与空白对照组比较，正常组卵泡成活数有增多趋势，差异有统计学意义（P＜0.05);与空白对照组比较，疏肝低、中、高剂量组和补肾低、中、高剂量组的卵泡成活数增高，差异有统计学意义（均P＜0.05）;与正常组比较，补肾各剂量组和疏肝各剂量组的卵泡成活数均升高，其中补肾高剂量组卵泡成活数最高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余依次为疏肝中剂量组、疏肝高剂量组、补肾中剂量组，差异均有统计学意义（P＜0.05）;疏肝低剂量组及补肾低剂量组间无统计学差异（P＞0.05）。
　　3各组体外培养小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表达
　　3.1体外培养不同时间点各剂量组间GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表达
　　空白组及正常组:与D2比较，D4、D6 GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低（P＜0.05）。疏肝各剂量组:与D2比较，D4、D6 GDF-9 mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05);BMPRⅡ、ALK5mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低（P＜0.05）;与D2比较，D4、D6 Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达有下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。补肾各剂量组:与D2比较，D4、D6 GDF-9mRNA表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05); BMPRⅡ、ALK5 mRNA表达均降低（P＜0.05），且D6较D4表达更低（P＜0.05）;D2、D4、D6 Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达有下降趋势，但差异无统计学意义。
　　3.2各组之间小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表达
　　在体外培养的D2、D4、D6:
　　正常组较空白组卵母细胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、 Smad3、Smad4 mRNA表达均有升高趋势，但差异无统计学意义（均P＞0.05）;
　　与空白组、正常组比较，疏肝低、中、高剂量组卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达均升高（均P＜0.05）;且疏肝中剂量组GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达高于疏肝高剂量组及疏肝低剂量组（均P＜0.05）;疏肝高剂量组表达高于疏肝低剂量组(P＜0.05)。与正常组、空白组比较，补肾低、中、高剂量组的卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4mRNA表达升高（均P＜0.05）;且补肾高剂量组GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA表达较补肾中、低剂量组均升高(均P＜0.05)，呈剂量依赖性。
　　疏肝低、中、高剂量组与补肾低、中、高剂量组之间比较，补肾高剂量组卵母细胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4 mRNA的表达高于疏肝中剂量组，其次各组表达由高至低依次为补肾中剂量组、疏肝高剂量组、补肾低剂量组、疏肝低剂量组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。各治疗组之间ALK5 mRNA表达比较，补肾高剂量组表达最强，差异有统计学意义（P＜0.05），其次依次是疏肝中剂量组、补肾中剂量组、补肾低剂量、疏肝高剂量组、疏肝低剂量组。各治疗组之间BMPRⅡmRNA表达比较，疏肝中剂量组表达最高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其余依次是疏肝高剂量组、补肾高剂量组、补肾中剂量组、疏肝低剂量组和补肾低剂量组。
　　4各组体外培养小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达
　　4.1体外培养不同时间点各组小鼠卵母细胞GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达
　　空白组及正常组:与D2比较， D4、D6 GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低（P＜0.05）。疏肝各剂量组:与D2比较， D4、D6 GDF-9蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低(P＜0.05); BMPRⅡ、ALK5、Smad4蛋白表达均降低(均P＜0.05)，且D6较D4表达更低（P＜0.05）;与D2比较，D4、D6 Smad2、Smad3蛋白表达有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　补肾低、中、高剂量组:与D2比较，D4、D6 GDF-9蛋白表达均降低（均P＜0.05），且D6较D4表达更低(P＜0.05)。BMPRⅡ、ALK5蛋白表达均降低(均（P＜0.05)，且D6较D4表达更低（P＜0.05）。D2、D4、D6Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达有下降趋势，但无统计学意义。
　　4.2各组之间小鼠卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达
　　在体外培养的D2、D4、D6:
　　正常组比空白组卵母细胞中GDF9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达均升高(均P＜0.05)。
　　与空白组、正常组比较，疏肝低、中、高剂量组卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达升高（均P＜0.05）;且疏肝高剂量组蛋白表达最高，其次为疏肝中、低剂量组，呈剂量依赖性。与正常组、空白组比较，补肾低、中、高剂量组的卵母细胞中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达升高（均P＜0.05）;且补肾高剂量组蛋白表达最高，其次为补肾中剂量组和补肾低剂量组，呈剂量依赖性。
　　疏肝低、中、高剂量组与补肾低、中、高剂量组之间比较，补肾高剂量组卵母细胞中GDF-9、Smad2、Smad3、Smad4蛋白的表达高于疏肝高剂量组，其次分别为补肾中剂量组、疏肝中剂量组（P＜0.05），补肾低剂量组与疏肝低剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。各治疗组之间BMPRⅡ蛋白表达的比较，疏肝高剂量组最高，差异有统计学意义（P＜0.05)，其余各组表达由高至低依次是疏肝中剂量组、补肾高剂量组、补肾中剂量组、疏肝低剂量组和补肾低剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05)。各治疗组之间ALK5蛋白表达比较，补肾高剂量组最高，差异有统计学意义(P＜0.05)，其次依次是补肾中剂量组、疏肝中剂量组、补肾低剂量、疏肝高剂量组、疏肝低剂量组。
　　结论:
　　1逍遥丸和补肾调经方含药血清可提高体外培养小鼠窦前卵泡的存活数，且随着培养时间的延长、卵泡的发育，两方提高卵泡成活数的作用更加显著。
　　2体外培养小鼠卵母细胞D2、D4、D6过程中，GDF-9、BMPRⅡ、ALK5 mRNA及蛋白表达呈逐渐下降趋势，提示卵母细胞分泌因子GDF-9及其受体在卵泡发育初期促进卵母细胞发育的作用更加明显。
　　3逍遥丸和补肾调经方对体外培养乳鼠卵母细胞D2、D4、D6过程中GDF-9、BMPRⅡ、ALK5 mRNA及蛋白表达亦呈逐渐下降趋势，但两方均可通过上调体外培养不同时间点小鼠卵母细胞中GDF-9 mRNA及其蛋白的表达，提高窦前卵泡的成活率。其机制可能是诱导GDF-9与其Ⅱ型受体BMPRⅡ形成复合物，进而募集Ⅰ型受体ALK5，然后使其发生磷酸化而活化，活化的ALK5进一步磷酸化细胞内的信号因子Smad2、 Smad3、Smad4，进而调控信号转导。两方提高卵泡发育初期卵母细胞质量的作用更为明显。
　　4补肾调经方影响GDF-9信号通路的作用呈剂量依赖性，即高剂量组效果最优。
　　5在体外培养小鼠卵泡过程中，疏肝各剂量组上调GDF-9Ⅱ型受体BMPRⅡ mRNA及蛋白表达的作用优于补肾各剂量组，补肾各剂量组上调Ⅰ型受体ALK5 mRNA及蛋白表达的作用优于疏肝各剂量组。补肾高剂量组上调Smad2/3/4 mRNA及蛋白表达的作用最强。提示补肾法、疏肝法对小鼠体外卵泡发育过程中卵母细胞GDF-9及其信号通路的作用的环节不尽相同，逍遥丸可能主要通过上调GDF-9Ⅱ型受体BMPRⅡ mRNA及蛋白表达引起对下游信号分子的变化，进而对卵泡发育发生调控作用，补肾调经方可能主要调控Ⅰ型受体ALK5 mRNA及蛋白表达从而调控下游信号分子影响卵泡的发育。
　　6逍遥丸和补肾调经方具有提高卵母细胞质量的作用，尤其是在卵泡发育早期此作用更为显著。

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材料与方法

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附图

附表

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结论

参考文献

综述 体外培养小鼠窦前卵泡研究

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