小鼠真皮间充质干细胞局部注射对硬皮病小鼠模型局部皮损和转化生长因子-β1影响的实验研究

摘要

目的:硬皮病是一种以弥漫性微血管病变伴皮肤和内脏器官纤维硬化为特征的自身免疫性结缔组织病。病变仅局限于皮肤者称为局限性硬皮病（又称为硬斑病），累积系统者称为系统性硬皮病。硬皮病的病因和发病机理复杂，涉及一系列细胞、细胞因子、趋化因子的变化，目前仍不明确，胶原合成过多，分解减少，大量胶原纤维沉积在皮肤、肺等组织器官是其主要病理过程之一。近年来国内外学者的研究发现转化生长因子-β1(TGF-β1)在硬皮病纤维硬化的形成和发展过程中起重要作用。研究TGF-β1与硬皮病发病的关系，可以为阐明硬皮病的发病机制提供部分理论依据，对硬皮病的治疗提供重要指导。由于硬皮病的病因和发病机制不明，因此尚无确切有效的治疗方法，目前主要是使用免疫抑制剂、抗纤维化和血管活性药物等对症治疗，但其副作用大疗效较差。随着近年来对干细胞研究的深入，其在医学顽疾治疗领域取得了令人瞩目的成绩，而间充质干细胞作为这一家族的新发现成员，具有强大的增殖能力、免疫调节功能和低免疫原性等特征，临床应用优势明显。目前已有动物实验研究发现可通过间充质干细胞的局部注射或系统输注，而发挥其免疫调节和组织修复作用。本实验拟通过成功建立硬皮病小鼠模型，局部皮下注射小鼠真皮间充质干细胞(mdMSCs)，通过比较注射组和对照组局部皮损外观变化、胶原纤维染色变化和真皮厚度来观察间充质干细胞对局部皮损的治疗作用，并通过检测注射前后局部皮损TGF-β1的表达定量来探讨其中的可能机制，从而为硬皮病局部皮损的临床治疗提供理论依据。
　　方法:
　　1取出生1天的BALB/c雄性小鼠皮肤组织进行胰酶消化，培养贴壁细胞，并传代培养。
　　2通过观察培养得到的细胞形态、使用流式细胞仪进行细胞周期和表面标志物CD44、CD29的测定来对小鼠真皮间充质干细胞进行鉴定。
　　3使用PKH26标记小鼠真皮间充质干细胞，并观察染色对细胞生长和增殖的影响。
　　4硬皮病动物模型的建立:将24只SPF级雌性6周龄BALB/c小鼠随机分为A、B、C三组，A组（11只）、B组（11只）为博莱霉素注射组，C组（2只）为PBS注射组。使用500μg/mL博来霉素稀释液0.1mL皮下注射入A、B两组小鼠背部，PBS注射液0.1mL皮下注射入C组小鼠背部，每日1次连续3周观察局部皮损外观变化，第3周末分别随机断颈处死各组中的2只小鼠取局部皮肤活检，证实造模成功。
　　5将PKH26标记的小鼠真皮间充质干细胞的细胞密度调至5×106/0.25mL，皮下注射入A组各小鼠背部皮损区，0.25mL/只。B组各小鼠背部皮损区皮下注射PBS液，0.25mL/只。让小鼠自由进食水，观察并记录两组小鼠的状态和局部皮损变化。
　　63周后，将两组小鼠全部断颈处死，切取各小鼠背部皮损区皮肤行组织固定，石蜡包埋，分别行HE染色、苦味酸-酸性品红胶原纤维染色和TGF-β1免疫组织化学SP法染色。在荧光显微镜下观察mdMSCs在A组小鼠局部皮肤内的分布。应用医学彩色病理图像分析系统测量两组小鼠的真皮厚度，采用多功能真彩色细胞图象分析管理系统对切片中TGF-β1的相对含量进行定量分析，计算TGF-β1的免疫组化评分。
　　7运用统计学软件SPSS17.0对数据进行分析。
　　结果:
　　1使用胰酶消化、培养贴壁细胞方法分离纯化细胞，可逐步得到成纤维细胞形态样的间充质干细胞。所得到的间充质干细胞大部分细胞处于静止期(G(O)/G1期:83.02％)，只有少部分处于分裂期(G2/S期:16.98％，其中G2/G1期:1.95％)。第3代小鼠真皮间充质干细胞中表面标志物CD44+，CD29+双阳性的细胞约为90％。
　　2 PKH26标记的小鼠真皮间充质干细胞胞膜均匀红染，细胞体积大小、密度与光镜下基本一致，子代也有荧光。荧光染料未对干细胞的生长和增殖产生明显影响。
　　33周后博来霉素注射组小鼠背部注射区域皮肤硬化增厚明显，未见毛发生长，弹性差。PBS对照组小鼠背部注射区皮肤未见明显变化。组织切片HE、苦味酸-酸性品红染色结果示造模组比对照组注射区真皮层明显增厚，胶原纤维明显增多，增粗，密集分布甚至融合成片，排列紊乱，均质化，真皮中下部血管管壁增厚，脂肪层变薄，局部炎细胞浸润。TGF-β1免疫组织化学染色结果示TGF-β1在对照组表皮和真皮层呈灶状弱阳性表达，在造模组的表皮棘层、基底层、真皮层及毛囊均呈强阳性表达。从而成功诱导出局限性硬皮病小鼠模型。
　　4 PKH26标记的小鼠真皮间充质干细胞皮下注射3周后，荧光显微镜下观察可见干细胞分布于真皮层和皮下组织。
　　5 mdMSCs5×106皮下注射3周后两组小鼠均存活，实验组（A组）小鼠背部注射区皮肤较前软化，弹性部分恢复。对照组（B组）小鼠背部皮损较前无明显变化。实验组HE染色、苦味酸-酸性品红染色组织切片示胶原纤维较前变细，数量减少，真皮层变薄，局部毛细血管增生。对照组组织学表现较前未见明显变化。实验组真皮厚度较对照组显著变薄，有统计学差异（P＜0.05）。
　　6 TGF-β1免疫组织化学SP法染色结果示TGF-β1在实验组和对照组的表皮棘层、基底层、真皮层及毛囊均呈强阳性表达，TGF-β1在实验组和对照组的表达定量（免疫组化评分）无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　1使用博来霉素500μg/mL连续皮下注射BALB/c小鼠背部，1次/日，0.1ml/次，3周后可成功建立具有局部皮肤损害的硬皮病小鼠动物模型。
　　2小鼠真皮间充质干细胞局部皮下注射可有效改善硬皮病小鼠模型局部皮损的硬化程度和胶原含量，但这一治疗作用可能并不是通过小鼠间充质干细胞对皮损局部TGF-β1的调控而实现的，至少不是通过对TGF-β1单一调控实现的。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 硬皮病发病机制和治疗方法的新进展

致谢

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