生长因子VEGF,GDF-9、GDF-15在重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障中的水平变化

摘要

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是临床常见的一种急腹症，起病急、并发症多。在SAP时，细菌可通过受损的肠粘膜移位引起的继发感染起着至关重要的作用。研究发现，SAP时肠黏膜屏障功能受到损伤，肠黏膜的通透性增高，肠道内毒素及细菌容易发生移位，甚至败血症，诱发和加重全身炎症反应综合征(systemic inflammatory responsesyndrome，SIRS)、多器官功能障碍综合症(Multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)，这是导致SAP死亡的主要原因。SAP时肠黏膜屏障功能的作用至关重要。研究影响肠黏膜屏障功能的因素，减少肠黏膜屏障功能的损伤，对SAP的治疗很有帮助。近年来生长因子在SAP的发生发展过程中的作用越来越引起人们的重视。
　　生长因子(growth factor)是一类多肽类物质，能与亲和力高的、特异的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等。生长因子有很多种，如表皮生长因子类（转化生长因子α，表皮生长因子）、类胰岛素生长因子(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β家族(TGF-β、骨形态发生蛋白BMP、活化素、生长分化因子GDF)等。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及生长分化因子(Growth Differentiation Factor, GDF)，在急性胰腺炎中的作用越来越受重视，VEGF能增加血管通透性，促进血管内皮细胞的增殖，在刺激生长和病理性血管新生中起主要作用。GDF在多种病理及生理情况下，发挥促凋亡、抗肿瘤的作用，他们在SAP时肠黏膜损害中的作用研究较少。
　　目的:本实验旨在通过测定VEGF，GDF-9、GDF-15蛋白及mRNA在SAP大鼠小肠中的表达情况，分析VEGF，GDF-9、GDF-15在重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障中的水平变化;并通过分析应用NOD通路抑制剂二甲基苯甲酰羟甲酮（Caspase-1抑制剂）预处理后的小肠VEGF，GDF-9、GDF-15的变化，初步探讨VEGF，GDF-9、GDF-15在重症急性胰腺炎肠黏膜屏障中的意义。
　　方法:将60只SD大鼠随机分成假手术(N)组、急性胰腺炎(SAP)组和急性胰腺炎+Caspase-1抑制剂(SC)组，各组再分为6h、12h2个亚组，每个亚组各10只，应用5％牛磺胆酸钠逆行注入胰管内的方法制作动物模型。分别在造模后6h、12 h留取胰腺、血、回肠，进行HE染色，观察胰腺及肠道的组织病理学变化，应用ELISA方法检测血浆中D-乳酸水平以评价肠黏膜通透性，应用Western-blot、RT-PCR的方法观察比较三组VEGF，GDF-9、GDF-15蛋白及mRNA的表达的异同。
　　结果:
　　1、胰腺组织的病理评分:HE染色结果示:N组大鼠6h的胰腺组织细胞形态大致正常，12h偶见细胞水肿;SAP组胰腺组织可见炎性反应、组织充血水肿、出血及坏死灶，12 h比6h更明显;SC组胰腺病变较SAP组轻，可见较少炎症细胞浸润、出血及坏死灶;病理学评分示，SAP组、SC组各时间点胰腺的病理学评分与N组比较，评分升高(P＜0.01)，SC组与SAP组比较评分减低，6h组与12h组均有统计学意义(P＜0.01)，SAP、SC组组胰腺病理评分12h组比6h组显著增高(分别P＜0.01，P＜0.05)，N组6h与12h时间点相比，没有显著差异(P＞0.05)。
　　2、肠道病理评分:N组大鼠肠黏膜结构正常，无炎症细胞浸润;SAP组大鼠可见绒毛及上皮层坏死脱落，可见炎症细胞浸润;SC组可见较少炎症细胞浸润，偶见上皮及绒毛结构不完整;SAP组和SC组与N组相比，评分显著升高(P＜0.01);SC组较SAP组病理学变化减轻，评分降低(P＜0.01);N、SC组6h与12h相比，没有显著差异(P＞0.05)，SAP组12h时间点高于6h(P＜0.05)。
　　3、血浆D-乳酸水平:N组的6h与12h之间相比，没有显著差异(P＞0.05)，与N组两个时间点相比，SAP组大鼠血浆D-乳酸含量均有所升高(P＜0.01)，SC组含量较N组的各个时间点升高(P＜0.01);SC组各时间点与SAP组相比是显著下降(P＜0.01);SAP组和SC组血浆D-乳酸水平12h组均高于6h水平(P＜0.05)。
　　4、小肠组织VEGF的表达:Western blot检测VEGF蛋白的表达情况，SAP组、SC组与N组6h、12h相比，蛋白表达均显著增高(P＜0.01);SC组与SAP组相比均减低(P＜0.01);各组6h与12h之间相比，SAP、SC组有差异，12h组表达量高于6h组(P＜0.05)，N组没有显著差异(P＞0.05)。RT-PCR检测VEGFmRNA表达情况，SAP组与N组相比，表达均明显增高(P＜0.01)，SC组与SAP组相比VEGF mRNA表达减低，有统计学意义(P＜0.05)，但较N组6h、12h表达增高（分别P＜0.05，P＜0.01）。各组6h与12h之间相比，SAP、SC组有差异，12h组表达量高于6h组(P＜0.05)，N组没有显著差异(P＞0.05)。
　　5、小肠组织GDF-15的表达:Western blot检测GDF-15蛋白的表达情况，SAP组、SC组与N组比较，蛋白表达均显著增高(P＜0.01);SC组与SAP组相比无明显改变;各组两个时间点之间相比，SAP、SC组有差异，6h组表达量高于12h组(P＜0.01)，N组没有显著差异(P＞0.05)。RT-PCR检测GDF-15的表达情况，SAP组、SC组与N组比较GDF-15mRNA表达增高(P＜0.05)，SC组与SAP组相比无明显差异。各6h与12h之间相比，SAP组有差异，6h组表达量高于12h组(P＜0.01)，SC、N组没有显著差异(P＞0.05)。
　　6、小肠组织GDF-9的表达:Western blot检测GDF-9蛋白的表达情况，SAP组、SC组与N组相比，6h组、12h组蛋白表达均增高(P＜0.01)，SC组与SAP组相比，6h组、12h组均减低(P＜0.05);各组两个时间点之间相比，SC组、SAP组有差异(P＜0.05)，且6h组表达量高于12组，N组没有显著差异(P＞0.05)。RT-PCR检测GDF-9mRNA表达情况，SAP组、SC组与N组相比，6h组、12h组表达均增高(P＜0.01)，SC组与SAP组相比，6h组、12h组均减低，有统计学意义(P＜0.01);各组两个时间点之间相比，SC组、SAP组有差异(P＜0.05)且6h组表达量高于12h组，N组无明显差异(P＞0.05)。
　　7、小肠组织VEGF蛋白的表达与血浆中D-乳酸的表达水平呈正相关。
　　结论:
　　1、SAP大鼠小肠组织中VEGF、GDF-15、GDF-9呈高表达，为肠黏膜屏障调节因子。
　　2、NOD通路抑制剂二甲基苯甲酰羟甲酮（Caspase-1抑制剂）可抑制NOD通路活性减轻胰腺及肠黏膜的损伤，减少肠黏膜VEGF、GDF-9的表达，不影响GDF-15的表达。

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材料及方法

结果

附图

附表

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结论

参考文献

综述 生长因子对急性胰腺炎肠黏膜屏障功能的影响

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