EC-SOD在大鼠肝缺血再灌注损伤模型心肌内的表达变化

摘要

肝缺血再灌注损伤（hepaticischemiareperfusioninjury，HIRI）是肝脏外科手术如肝脏移植、肝部分切除等临床治疗过程中经常会发生的并发症，这也是引发患者肝移植失败，肝功能衰竭及愈后较差的关键因素。众多研究已表明：暂时性阻断肝脏血流供应，然后再重新恢复其灌注时可诱发氧化应激反应的发生，产生大量高活性的活性氧族（reactiveoxygenspecies：ROS)，ROS对肝脏组织细胞引发的过氧化损伤是导致HIRI的主要机制。ROS的成员主要有超氧阴离子（O2-.）、过氧化氢（H2O2）以及羟自由基(OH.)等。ROS的生物化学性质极其活泼，能与胞内和胞膜上的一些重要蛋白（如结构蛋白和功能蛋白）和脂质发生过氧化反应，从而破坏胞膜的结构，损害细胞功能，甚至引起细胞和组织的死亡。
　　肝脏不仅是糖类、蛋白和脂类等物质的重要代谢场所，还是重要的分泌、排泄和生物转化器官。因此，当其结构和功能受到损害时必然会引起机体内其他重要脏器的结构和功能异常。心脏是机体内氧气消耗量大、对缺血缺氧反应极为敏感的脏器。当暂时阻断肝脏血供再重新恢复其灌注，肝组织细胞遭受氧化应激损伤时，心脏是否也会遭受过氧化损伤？有待研究。
　　超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutases，SOD）是机体内重要的抗氧化酶之一，它能催化O2-氧化生成氧和H2O2。因此，SOD是清除O2-的重要酶蛋白，在机体内的抗过氧化过程具有重要作用。哺乳动物体内共有三种SOD亚型：在线粒体内以锰作为辅基的锰-超氧化物歧化酶（Mn-SOD），在细胞胞浆中以铜和锌作为辅基的铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。细胞外超氧化物歧化酶（extracellularSOD,EC-SOD)是机体内唯一位于细胞外的SOD亚型，它依靠自身的肝素结合域(heparin-bindingdomain,HBD)能与细胞外基质和细胞表面结合。以往众多的抗氧化功能研究主要集中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但最近的实验研究发现：细胞外的EC-SOD在机体内的抗氧化应激和抗炎反应中可能发挥了更重要的作用。研究显示：心肌组织内EC-SOD含量降低的病人，其发生高血压和缺血性心脏疾病的风险明显增加。EC-SOD与细胞外基质结合能力下降也会增加心血管和缺血性心脏疾病的风险。此外，心脏衰竭患者的EC-SOD表达是降低的。这表明EC-SOD可能对维持心肌功能具有重要作用。EC-SOD在肝脏缺血再灌注损伤模型心肌组织内的表达如何变化，是否在此过程中发挥了抗氧化作用，未见报道。
　　本研究通过阻断大鼠肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂再重新恢复其灌注的方法制造大鼠HIRI模型，然后观察大鼠心肌组织内MDA含量、H2O2含量、血清LDH水平，以及EC-SOD的mRNA和蛋白表达水平。探讨肝脏缺血再灌注损伤发生后心肌组织内的氧化应激状态以及EC-SOD的抗氧化作用。
　　目的：
　　观察大鼠肝缺血再灌注损伤模型心肌组织内的MDA和H2O2含量，抗氧化酶EC-SOD的mRNA和蛋白表达水平的改变，探讨肝缺血再灌注损伤发生后心肌组织的氧化应激状态及EC-SOD在此过程中可能发挥的抗氧化作用。
　　方法：
　　1、大鼠肝缺血再灌注损伤模型的制备及取材
　　选用12只雄性健康Wistar大鼠，体重190-210g，于河北医科大学实验动物中心购得。随机分为肝缺血再灌注损伤组(HIRI)6只，对照组（Con）6只。6％水合氯醛（自配）按0.5ml／kg计量，对大鼠进行腹腔注射，将其麻醉。参照Kohli等人的方法，用玻璃针轻柔分离肝血管和胆管，游离出通往肝中叶和肝左叶的血管和胆管蒂，用无损伤血管夹将其夹闭。30分钟后移开血管夹，恢复肝中叶和肝左叶的血液供应，制造肝实质70%的肝缺血再灌注损伤模型。对照组大鼠麻醉后，只游离肝中叶和肝左叶的血管和胆管蒂，30分钟后关腹。肝脏恢复血供6小时后再次将其麻醉，收集大鼠血液，用于ALT（丙氨酸氨基转移酶）和LDH（血清乳酸脱氢酶）的活性测定；取大鼠肝脏，将其置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，用HE染色法观察大鼠肝组织的形态学改变；取大鼠心脏，用冰生理盐水洗去心脏表面及心腔内的余血，并将心脏置于液氮中用于EC-SOD的mRNA水平和蛋白水平测定，以及MDA含量和H2O2含量测定。
　　2、测定指标及方法
　　2.1HE染色法观察大鼠肝脏的形态结构
　　肝组织经常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋后，进行切片，厚度约5μm，用苏木精伊红染色，在日产Olympus光学显微镜下观察大鼠肝脏组织的形态结构变化。
　　2.2大鼠血清中ALT活性的测定
　　大鼠血液未经抗凝处理，3000rpm离心10min后分离血清，用血清ALT全自动生化分析仪测定其含量。
　　2.3大鼠血清中LDH活性的测定
　　大鼠血液LDH活性的测定，按照试剂盒的操作说明，采用LD-L速率法测定。
　　2.4大鼠心肌匀浆的制备以及MDA含量的测定
　　从-80℃冰箱中取出肝缺血再灌注损伤组及对照组大鼠的心肌组织，按照10mg/100μl的比例，加入4度匀浆缓冲液(PH7.4，磷酸钾缓冲液50mmol/L，PMSF1mmol/L，盐酸苯甲脒1mmol/L，NaCl0.5mol/L，0.1%Tween-20，β-巯基乙醇5mmol/L，EDTANa31mmol/L)，冰浴中匀浆，4℃匀浆液4000rpm离心20分钟，取上清即制成10％心组织匀浆，心组织匀浆内MDA含量经南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。
　　2.5大鼠心肌组织H2O2含量测定
　　将从-70℃冰箱中取出的心肌组织按照10mg/100μl加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液，PH7.4，1mmol/L盐酸苯甲脒，1mmol/LPMSF，0.1%Tween-20，0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTANa3，5mmol/Lβ-巯基乙醇)，冰浴中匀浆，匀浆液4000rpm4℃离心20min，取上清即制成10％心肌组织匀浆。心肌组织匀浆内H2O2含量采用钼酸比色法测定，以每克样本蛋白所含的过氧化氢的量(mmol/gpro)表示。
　　2.6大鼠心肌组织EC-SODmRNA水平测定
　　用TRIzol法提取大鼠心肌组织总RNA。将3μgRNA反转录生成cDNA。用GAPDH作为内参照，进行RT-PCR。用EC-SOD扩增产物的灰度值与GAPDH扩增产物的灰度值相比，表示目的基因EC-SOD的相对表达量。
　　2.7大鼠心肌组织EC-SOD蛋白水平测定
　　采用Westernblotting的方法测定大鼠心肌组织内EC-SOD蛋白的相对表达量。将-80度冷冻的大鼠心肌组织制成匀浆液,离心后取上清。采用改良的Lowry法进行蛋白总量测定。大鼠心肌组织的蛋白上样量为62ug。经转膜、封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD一抗,室温静置过夜。洗膜后，再加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG二抗。按照发光试剂操作说明进行显影、定影、晾干。后对胶片进行扫描处理，并做图像分析，以EC-SOD条带的灰度值与内参照GAPDH灰度值之比表示EC-SOD的相对表达量。
　　结果：
　　1、大鼠肝脏形态学改变
　　在光学显微镜下可见肝缺血再灌注损伤组大鼠的肝组织淤血严重，肝细胞受压萎缩，肝血窦扩张充血明显，肝细胞胞浆内有空泡出现并且染色变浅，有部分肝细胞水肿，染色变浅，体积增大。对照组大鼠肝细胞排列整齐成条索状，围绕中央静脉排列成放射状，肝血窦无扩张充血大小均匀。
　　2、血清ALT水平
　　Con组大鼠血清中ALT为20.03±5.23U/L，而HIRI组血清ALT为87.43±9.06U/L。HIRI组大鼠血清ALT水平明显高于Con组（P<0.01）。
　　3、血清LDH水平
　　Con组大鼠血清中LDH为481.5±67.15U/L，而HIRI组血清LDH为658.83±94.15U/L。HIRI组大鼠血清LDH水平明显高于Con组（P<0.01）
　　4、心肌组织内MDA的含量
　　Con组大鼠心肌组织MDA的含量为9.24±1.72mmol/g，而HIRI组MDA含量为12.73±1.84mmol/g。HIRI组大鼠心肌组织MDA的含量明显高于Con组（P<0.01）
　　5、心肌组织内H2O2含量
　　Con组大鼠心肌组织内H2O2的含量为10.56±1.72mmol/g，而HIRI组心肌组织内H2O2含量为14.63±2.25mmol/g。HIRI组大鼠心肌组织内H2O2的含量明显高于Con组（P<0.01）
　　6、大鼠心肌组织内EC-SODmRNA的相对表达量
　　大鼠心肌组织内抗氧化物酶EC-SODmRNA的相对表达量采用RT-PCR的方法测定。计算与内参照GAPDH的比值得出其相对表达量并进行结果统计。分析表明：HIRI组大鼠心肌组织的EC-SODmRNA水平（1.01±0.15）均明显高于Con组（0.69±0.11,P<0.01）。说明HIRI组大鼠心肌组织内EC-SOD的表达明显增强。
　　7、大鼠心肌组织中EC-SOD的蛋白相对表达量
　　采用Westernblotting的方法测定大鼠心肌组织内EC-SOD的蛋白相对表达量。计算与内参照GAPDH的比值得出相对表达量并进行结果统计。分析表明：HIRI组大鼠心肌组织中EC-SOD蛋白的相对表达量（0.69±0.09）明显高于对照组（0.48±0.07）（P<0.01）。
　　结论：
　　1、结扎肝左、中血管和胆管蒂可成功建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型。
　　2、大鼠肝缺血再灌注损伤模型心肌组织内MDA含量、H2O2含量和血清LDH活性均明显增加，提示：心肌组织已遭受过氧化损伤，心肌功能受损。
　　3、心肌组织内EC-SOD的mRNA和蛋白表达水平在肝脏缺血再灌注损伤模型心肌组织中明显增强。提示：抗氧化酶EC-SOD在此过程中可能发挥了抗氧化作用。

目录

封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3数据处理

结果

1大鼠肝组织的形态学改变

2血清ALT水平

3血清LDH水平

4心肌组织内MDA的含量

5心肌组织内H2O2含量

6大鼠心肌组织内EC-SOD mRNA的相对表达量

7大鼠心肌组织中EC-SOD的蛋白相对表达量

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: 肝缺血再灌注损伤机制及对心肌的影响

致谢

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