GeXP系统在先天性心脏病相关基因突变筛查以及呼吸道病毒多重检测中的应用

摘要

GenomeLabGeXP（GeneExpressionProfiler）多基因表达遗传分析系统由美国贝克曼公司研发，最初主要用于研究多重基因表达定量分析。该平台将多重聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）技术和毛细管电泳技术相结合，只需一个反应即可从5ng~500ngRNA样品中同时检测多达35个基因表达丰度。GeXP系统一束八道的毛细管阵列设计充分利用96孔板的矩阵排列，在双通道设置时可同时检测高达192个样品并且允许自动更换不同的方法，有利于质量控制及方法开发的应用；对毛细管进行液体制冷及利用半导体控温系统，可得到精确的控温和最好的分辨率；此外，GeXP系统备有紫外、两极管矩阵及双激光诱发萤光三种检测器，能够配合不同的应用。总体来说GeXP系统在很大程度上提高了检测的灵敏度和速度，把基因表达研究提升到了一个更高的水平。
　　近年来，由于GeXP系统本身所具备的巨大优势它已广泛应用于药物毒力机制研究、拟南芥与铁吸收相关多基因表达调控、癌症早期诊断研究、免疫治疗、疾病分子分型、个体化用药指导、多病原鉴定及其耐药性突变检测等医学研究和临床检验领域。本研究共分两部分：第一部分使用GeXP系统同时检测了8个先天性心脏病相关突变位点并分型，探讨其与先心病发生的相关性；第二部分使用GeXP系统同时检测呼吸道临床样本中的11种呼吸道病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体并进行方法学评估。
　　第一部分GeXP多重PCR技术同时检测8个先天性心脏病相关突变位点
　　目的：建立基于GeXP平台的多重基因分型系统，在同一PCR体系内同时检测与先天性心脏病（简称先心病）相关的6个致病点突变及2个单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）并分型，探讨其与先心病发生的相关性。
　　方法：选取与先心病相关的CRELD1、TBX20、GATA4、TBX5、NKX2-5及TBX1共6个已报道的致病点突变和MTHFR基因的两个SNP位点设计特异性引物，建立GeXP多重PCR反应体系，评价其特异性。收集2013~2014年在河北省儿童医院心外科住院的256例先心病患儿和49例健康对照儿童血液标本，提取基因组核酸，使用所建立的方法进行基因分型，利用SPSS16.0统计软件的卡方检验进行统计分析。
　　结果：16个等位基因和1个PCR反应内参均可在同一个体系中扩增，17个片段清晰分离，且特异性良好。本研究中未检出CRELD1、TBX20、GATA4、TBX5、NKX2-5、TBX1基因的点突变，但MTHFR基因rs1801133位点CC基因型在健康对照组和复杂先心病组之间的分布具有统计学意义（χ2=4.051,P=0.044,OR=0.211,95％CI0.041~1.092）。
　　结论：本研究中未检出CRELD1、TBX20、GATA4、TBX5、NKX2-5、TBX1基因的单碱基突变，MTHFR基因rs1801133位点CC基因型与复杂先心病的发生可能相关，可用于先心病易感基因的筛查，并为孕妇产前检查及新生儿出生缺陷的风险评估提供遗传学依据。
　　第二部分基于GeXP系统同时检测11种呼吸道病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体的应用及评估
　　目的：评估基于GeXP系统同时检测11种呼吸道病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体的多重PCR技术，即13重呼吸道病原检测试剂盒（购自宁波海尔施基因科技有限公司）检测临床样本的能力。
　　方法：使用该技术检测302份取自河北省儿童医院住院儿童的鼻咽吸取物标本，并使用中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所中心实验室建立且已经过商业化xTAGRVP试剂盒检测验证过的GeXP多重检测方法作为参考标准进行呼吸道病毒的平行验证，肺炎支原体和肺炎衣原体的验证分别采用实时荧光定量PCR法和Sanger测序法。
　　结果：对于呼吸道病毒的检测，13重呼吸道病原检测试剂盒的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为95.13%、84.21%、94.71%和85.33%（以GeXP多重检测方法作为参考标准），两种方法的一致率为92.38%，Kappa值为0.92。13重呼吸道病原检测试剂盒检出的所有肺炎支原体和肺炎衣原体经验证均为真阳性。
　　结论：13重呼吸道病原检测试剂盒具有良好的临床标本检测能力，而且可检测肺炎支原体、肺炎衣原体和呼吸道病毒的混合感染，有助于指导临床诊断和治疗，避免抗生素的滥用。

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第一部分GeXP多重PCR技术同时检测8个先天性心脏病相关突变位点

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分基于GeXP系统同时检测11种呼吸道病毒、肺炎支原体和肺炎衣原体的多重PCR技术的应用与评估

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:先天性心脏病相关染色体微缺失综合征

致谢

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