七氟醚及右美托咪定对体外培养海马神经元发育的影响及机制研究

摘要

第一部分培养新生SD原代大鼠海马神经元、观察其形态学改变及纯度鉴定
　　目的：掌握新生 SD大鼠海马神经元的体外培养技术；观察新生原代大鼠 SD海马神经元的形态学改变；采用免疫荧光细胞化学方法鉴定神经元纯度。
　　方法：取新生24 h内的SD乳鼠，用碘酊和75％乙醇消毒，剪断头，分层剪开大鼠头部的皮肤和打开颅骨，用弯镊取出其整个大脑，置于预先冷却的 DMEM液中，找到并剥离两侧完整的海马组织，置于解剖显微镜下，剥离并去除海马表面的血管和被膜，移入加有木瓜酶的DMEM中，温度为37℃，置于5%CO2培养箱中，消化30分钟。置入含有10%血清的 DMEM液中2分钟，终止组织消化。在含有血清的DMEM液中，用维纳斯剪剪碎消化完成的组织块，反复轻轻吹打三到五次，置入200目细胞筛，过筛。取0.9 ml筛过的组织液,采用台盼蓝拒染法，计量活细胞数，将配制成1×106/ml密度的细胞悬液,每孔加500μl，种植于 Matrigel基膜包被的24孔培养板上，置于恒温37℃，5％CO2的培养箱内培养6 h。全量更换成无血清Neurobasal培养基。于培养的第48 h时，加入终浓度为10μmol/L的阿糖胞苷。此后每2天半量更换培养液，密切观察神经元的生长状态。于培养7天后，应用免疫荧光化学技术，按不同的荧光标记得情况，可以分清神经元和星形胶质细胞。应用荧光显微镜观察神经元的状况并镜下留取照片，用于计数。按照随机原则，分别选取3个孔的随机3个视野，高倍视野(10×20倍)下，对神经元、星形胶质细胞及所有细胞核进行计数，通过计算神经元所占的百分比的均值，作为每孔神经元纯度。
　　结果：体外培养的新生原代 SD大鼠海马神经元，形态典型，突起连接成网，生长状态良好；体外培养的新生原代 SD大鼠海马神经元细胞核染色清晰，海马神经元纯度为(94.81±1.90)%，各组间比较无统计学意义（P=0.81）。
　　结论：体外培养的原代 SD新生乳鼠海马神经元形态典型，纯度在90%以上，能够满足进一步的实验要求。
　　第二部分七氟醚对发育期海马神经元的影响
　　目的：探讨七氟醚对原代培养的发育期6d的SD乳鼠海马神经元影响
　　方法：取原代培养第6d的海马神经元，随机分为4组：对照组(C组)七氟醚组随机分成3组,分别供应对照组空气，1MAC七氟醚3h、6h、12h的七氟醚处理（F1组、F2组、F3组）。所有海马神经元继续培养12h后，为各组神经元全量换液，并用PBS清洗2次，加入培养基继续培养24h，随机选取视野为神经元拍照。所得照片用Motic Med6.0软件处理，使用其测量长度工具测量视野内轴突和树突的总长度，计数该视野神经元总数，以该视野神经元平均突起总长度作为统计指标。用免疫荧光化学法测定各组神经元突触素的含量，采集突触素荧光图像，用Image-Pro Plus6.0软件分析各组突触素的平均荧光密度（ MOD， mean optical density）。用流式细胞检测检测技术，检测各组海马神经元的凋亡情况。
　　结果：
　　1MAC七氟醚暴露3小时（F1组）同对照组（C组），神经元平均突起总长度差异无统计学意义（P>0.05）；F2组及F3组与C组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；F2组和F3与F1组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　F2组及 F3组与 C组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）；F1组与C组比较，差异无统计学意义；F2组和F3与F1组比较，数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　1MAC七氟醚暴露3小时（F1组）较对照组（C组），神经元凋亡率无明显差别，无统计学意义（P>0.05）;随着1MAC七氟醚暴露的时间延长及 F2和 F3组，神经元凋亡率逐渐增高，差异有统计学意义（P<0.05）;F2和F3组与C组和F1组比较，F2组和F3组神经元凋亡率增高，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：1MAC七氟醚暴露6小时及以上影响原代培养的乳鼠海马神经元突起及突触的发育，引起海马神经元的凋亡增加，可能引起乳鼠成年后学习和记忆功能的降低。
　　第三部分七氟醚对发育期海马神经元影响的可能机制
　　目的：探讨七氟醚对发育期海马神经元影响的可能机制。
　　方法：取原代培养第6d的海马神经元，随机分为4组：空白对照组(C组)、1MAC七氟醚3小时组（F1组）、1MAC七氟醚6小时组(F2组)、1MAC七氟醚12小时(F3组)。F1、F2、F3组分别暴露于1MAC七氟醚下； C组暴露于空气下。将海马神经元置于恒温水浴箱中，保持温度于37℃，应用DRAGER麻醉机，给于6L/min的气体流量，1Mac的七氟醚混合95%的空气和5%的CO2，连接已预先制备的玻璃容器内，应用七氟醚气体检测仪检测气体浓度，维持七氟醚在容器内为1MAC。对照组置于玻璃器皿内给于除七氟醚以外的气体。12小时后放回培养箱继续培养。Western blot检测各组BDNF和TrkB蛋白的表达。
　　结果：BDNF水平在暴露于1MAC七氟醚6小时（F2组）、12小时（F3组）较对照组（C组）图像可见有明显的降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小时（F1组）BDNF水平较对照组（C组）图像可见有明显的升高，差异有统计学意义（P<0.05）。BDNF灰度值水平,在暴露于1MAC七氟醚6小时（F2组）、12小时（F3组）较对照组（C组）有明显的降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小时（F1组）BDNF水平较对照组（C组）有明显的升高，差异有统计学意义（P<0.05）。C组和F1组、F2组、F3组内参β-actin条带灰度值，差异无统计学意义（P>0.05）。
　　TrkB水平在暴露于1MAC七氟醚6小时（F2组）、12小时（F3组）较对照组（C组）图像可见有明显的降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小时（F1组）TrkB水平较对照组（C组）图像可见有明显的升高，差异有统计学意义（P<0.05）。TrkB灰度值水平在暴露于1MAC七氟醚6小时（F2组）、12小时（F3组）较对照组（C组）有明显的降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而暴露于1MAC七氟醚3小时（F1组）TrkB水平较对照组（C组）有明显的升高，差异有统计学意义（P<0.05）。C组和F1组、F2组、F3组内参β-actin条带灰度值，差异无统计学意义（P>0.05）。
　　结论：
　　11MAC七氟醚暴露3小时增加了体外培养海马神经元 BDNF和TrkB表达但未引起海马神经元凋亡、突起和突触发育的改变。
　　21MAC七氟醚暴露时间6小时减少体外培养海马神经元BDNF和TrkB表达可能是七氟醚响海马神经元突起及突触发育和神经元细胞凋亡的分子机制之一。
　　3七氟醚对体外培养海马神经元的影响具有双向性，可能与七氟醚暴露的时间有关，其机制可能与七氟醚引起的BDNF和TrkB表达的改变相关。
　　第四部分右美托咪定对七氟醚引起的发育期海马神经元的神经毒性的影响
　　目的：探讨右美托咪定对七氟醚引起的发育期海马神经元毒性的影响。
　　方法：取原代培养第6d的海马神经元，随机分为5组：空白对照组(C组)、1MAC七氟醚组（F组）、右美托咪定组(D组)、1MAC七氟醚加右美托咪定组(FD组)、育亨宾组（Y组）。FD组分成FD1组给于右美托咪定0.1 umol/L;FD2组给于右美托咪定1 umol/L;FD3组给于右美托咪定10 umol/L。Y组分成：Y1组，Y2组，Y3组分别给予右美托咪定0.1 umol/L,1 umol/L,10 umol/L。F组、FD组和Y组分别暴露于1MAC七氟醚下6小时；D组加入生理盐水稀释的右美托咪定，使其终浓度为100 nmol/L，FD组采取1MAC七氟醚混合95%的空气和5%的CO2,6h同时加入生理盐水稀释的右美托咪定，使其终浓度为100nmol/L，C组和D组采用95%的空气和5%的CO2，Y组先加入育亨宾，使其终浓度为2umol/L，再加入右美托咪定和七氟醚，终浓度同FD组，F组和C组加入等体积的生理盐水。继续培养12h后，为各组神经元全量换液，并用PBS清洗2次，加入培养基继续培养24h，弃去培养基，用PBS清洗两次，收集每组细胞，利用Western Blot技术分析各组脑源性神经营养因子(BDNF，brain-derived neurotrophic factor)及其特异性受体TrkB和坍塌反应调节蛋白2（CRMP-2，collapsin response mediator protein-2）表达的改变。利用 Gel Image Analysis V2.02软件分析各条带的灰度值， BDNF，TrkB和CRMP-2蛋白的相对量分别以BDNF，TrkB和CRMP-2条带的灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示。用流式细胞检测检测技术，检测各组海马神经元的凋亡情况。
　　结果：1比较各组BDNF，TrkB和CRMP-2蛋白的表达
　　（1）BDNF：BDNF的表达水平，1MAC七氟醚暴露6小时（F组）及同时给于浓度为0.1 umol/L、1umol/L、10 umol/L右美托咪定（FD组）和Y组比对照组（C组），数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）；单纯右美托咪定组和对照组之间表达无明显差别，差异无统计学意义（P>0.05）;而复合1MAC七氟醚和三种剂量右美托咪定均较单纯1MAC七氟醚暴露，BDNF表达水平有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）；FD1组较FD2组和FD3组,BDNF表达水平明显降低（P<0.05）,FD2组与FD3组间表达无明显差别（P>0.05）;复合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨宾时，BDNF的表达水平较单纯1MAC七氟醚，数值有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）;复合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨宾时，BDNF的表达水平较 FD组，数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）而当给于不同剂量的右美托咪定的 Y1组、Y2组和 Y3组间,BDNF表达无明显差别。
　　（2）TrkB：TrkB的表达水平，1MAC七氟醚暴露6小时（F组）及同时给于浓度为0.1 umol/L、1umol/L、10 umol/L右美托咪定（FD组）和Y组比对照组（C组），数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）；单纯右美托咪定组和对照组之间表达无明显差别，差异无统计学意义（P>0.05）;而复合1MAC七氟醚和三种剂量右美托咪定均较单纯1MAC七氟醚暴露，TrkB表达水平有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）；FD1组较FD2组和FD3组,TrkB表达水平明显降低（P<0.05）,FD2组与FD3组间表达无明显差别（P>0.05）;复合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨宾时， TrkB的表达水平较单纯1MAC七氟醚，无明显差异（P>0.05）;复合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨宾时，TrkB的表达水平较 FD组，数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）而当给于不同剂量的右美托咪定的Y1组、Y2组和Y3组间,TrkB表达无明显差别（P>0.05）。
　　（3）CRMP-2:1MAC七氟醚暴露6小时（F组）及同时给于浓度为0.1 umol/L、1umol/L、10 umol/L右美托咪定（FD组）和Y组比对照组（C组），数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）；单纯右美托咪定组和对照组之间表达无明显差别，差异无统计学意义（P>0.05）;而复合1MAC七氟醚和三种剂量右美托咪定均较单纯1MAC七氟醚暴露，CRMP-2表达水平有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）；FD1组较FD2组和FD3组,CRMP-2表达水平明显降低（P<0.05）,FD2组与FD3组间表达无明显差别（P>0.05）;复合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨宾时，CRMP-2的表达水平较单纯1MAC七氟醚，数值有所升高，差异有统计学意义（P<0.05）;复合1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨宾时， CRMP-2的表达水平较 FD组，数值有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）而当给于不同剂量的右美托咪定的 Y1组、Y2组和 Y3组间,CRMP-2表达无明显差别（P>0.05）。
　　2比较各组海马神经元细胞的凋亡情况。
　　1MAC七氟醚暴露6小时（F组）及同时给于浓度为三种剂量的右美托咪定（FD组）和复合育亨宾的Y组均较对照组（C组），神经元凋亡率明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；单纯右美托咪定组和对照组之间表达无明显差别，差异无统计学意义（P>0.05）；而复合1MAC七氟醚和右美托咪定较单纯1MAC七氟醚暴露，神经元凋亡率明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）,其中FD1组较FD2组和FD3组,神经元凋亡率明显增高复合（ P<0.05）而 FD2组与 FD3组间无明显差异（P>0.05）;1MAC七氟醚、右美托咪定和育亨宾时，神经元凋亡率较单纯1MAC七氟醚，数值有所降低，较单纯复合右美托咪定组,凋亡率明显增高（P<0.05）;而给于不同剂量的右美托咪定复合七氟醚,育亨宾,Y1组、Y2组和Y3组间无明显差异（P>0.05）。
　　结论：
　　11MAC七氟醚减少体外培养海马神经元BDNF，TrkB和CRMP-2的表达可能是七氟醚影响海马神经元突起及突触发育的分子机制之一；
　　2右美托咪定使七氟醚孵育的体外培养海马神经元中BDNF，TrkB和CRMP-2的表达增加，可能是右美托咪定能减少七氟醚对体外培养海马神经元突起及突触发育影响的可能分子机制之一；但是右美托咪定本身却使体外培养海马神经元中TrkB的表达减少；
　　3阻滞α2肾上腺素受体可导致BDNF表达减少；
　　4咪唑啉受体可能参与了右美托咪定对七氟醚的神经毒性的保护作用（增加了CRMP的表达）。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

引言

参考文献

第一部分原代新生SD大鼠海马神经元的培养、鉴定及形态学观察

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分七氟醚对发育期海马神经元的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分七氟醚对发育期海马神经元影响的可能机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分右美托咪定对七氟醚引起的发育期海马神经元的神经毒性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:全身麻醉对婴幼儿的影响

致谢

个人简历