利用微卫星与SNP对几种实验小鼠与大鼠品系进行遗传监测的研究

摘要

在以实验动物为主要研究对象的科学研究中，实验动物的遗传质量是影响实验结果真实性的重要因素。在动物繁育和饲养过程中，遗传漂变和遗传污染等多种因素会造成实验动物遗传质量的改变，这会直接影响实验动物的生物学特性，进而影响实验结果的可重复性和准确性。因此，必须采用遗传监测来监控实验动物的遗传质量，确保实验动物品系的纯度和同质性，同时对不符合标准的群体及时淘汰，对新出现的亚系分支或突变品系及时进行正确处理。这对确保动物实验研究结果的可靠性等具有十分重要的理论及实践意义。
　　目前利用微卫星与SNP进行遗传检测的报道均各有侧重，对常见大鼠和小鼠品系的检测不够完善系统。所以有必要重新优选这些标记，建立针对常用大鼠和小鼠品系进行遗传监测的新优化体系，进而利用该体系对相关品系进行系统的检测来确定其变异程度以及是否有亚系形成。另外，目前国际上对基因修饰动物的遗传监测鲜有报道，尤其是对当今具最高免疫缺陷的X小鼠，其基因修饰是否会造成遗传监测标记的变异，这些变异的遗传监测标记与基因修饰间存在怎样的分子生物学关系，以及怎样利用这些标记对基因修饰动物进行遗传监测尚未见有报道。
　　本课题首先用微卫星作为遗传监测手段，经对PCR检测条件的优化改良，希望建立一套可以对5种小鼠和3种大鼠品系进行遗传监测的稳定可靠的监测体系。进而希望用所建立的微卫星监测体系对几个品系小鼠和近交系大鼠监测分析其遗传质量。然后，我们利用SNP作为遗传监测手段，筛选了分布于不同染色体的32个SNP位点对8个品系的小鼠（包括5个近交系、2个具免疫缺陷的突变系及相应的背景品系）进行了相应群体的遗传监测分析，希望得到近交系的变异程度以及在突变系中与遗传修饰相关的多态性位点。通过以上实验我们得到以下结果:
　　1、通过筛选数据库，并优化PCR反应及琼脂糖凝胶电泳条件，最后经改良建立了一种稳定可靠的微卫星检测分析方法，并建立了基于该方法的适合于5种近交系小鼠和3种近交系大鼠进行遗传监测鉴定的微卫星集合，进一步给出针对不同近交系遗传监测鉴定的最优微卫星使用组合。该检测体系可以对涉及到的大鼠与小鼠近交系进行系统快捷准确的检测鉴定，这对实验动物遗传监测鉴定具有重要价值。
　　2、利用建立的微卫星检测体系对相关小鼠与大鼠品系进行遗传监测，发现了一些分布于不同品系内的变异微卫星位点。这些变异位点可能是亚系形成过程的一种表征。
　　3、利用建立的检测体系，对免疫缺陷突变系X小鼠选择了24个微卫星位点进行检测，未发现X小鼠不同于背景小鼠的变异位点。说明在所选的24个微卫星位点中没有与相关基因突变有关的敏感位点。
　　4、用优选的32个SNP探针对5个近交系小鼠相关群体进行Q-PCR基因分型检测发现:①对于生产群， BALB/c小鼠在rs13483601(A/A→A/G)、rs13459176(A/A→A/C)与rs13482131(C/C→ C/T)位点发生突变; C3H小鼠在rs13459176(A/A→A/C)与rs13482131(C/C→ C/T)位点发生突变; DBA/2小鼠在rs13483295(T/T→G/T)位点发生突变; C57BL/6小鼠在rs3653651(C/C→C/T)、rs13459176(A/A→A/C)与rs13482131(C/C→ C/T)位点发生突变;129小鼠在30个检测位点均未发生突变;②对于核心群，在30个所检位点中仅rs13459176位点在C57BL/6、C3H、BALB/c小鼠部分样本中检测到杂合突变（A/A→A/C）。
　　5、以BALB/c小鼠为背景对照，对BALB/c Nude小鼠进行SNP基因分型检测发现:BALB/c Nude小鼠在rs13478818、rs13482843等7个位点发生突变。以背景小鼠为对照，对X小鼠进行SNP基因分型检测发现:X小鼠只在rs13478215位点发生突变（C/C→C/A; C/C→A/A），其他位点均与背景小鼠一致。这些位点的多态性表明其很可能是与基因修饰相关的一些“热点”。
　　结论:
　　1、建立的微卫星遗传监测鉴定体系是稳定可靠的。利用该体系对3种近交系大鼠与5种近交系小鼠进行检测鉴定发现了分布于这些动物中的一些突变位点。这表明这些近交系可能正逐渐分化为亚系或发生了遗传污染。对于发生了遗传污染或不需要的突变群体应及时淘汰，并重新引种或复苏冻存的胚胎重新扩繁。这对保证动物实验的准确性与精确性有重要意义。
　　2、对X免疫缺陷小鼠进行了24个微卫星位点的检测，未发现X小鼠不同于背景小鼠的变异。说明所选的24个微卫星位点都没有发生与基因修饰有关的突变。对X免疫缺陷小鼠中与突变基因相关的敏感微卫星位点的检测尚属首次，这对研究这些位点与所敲除免疫基因间的分子生物学机制具有重要借鉴价值。
　　3、通过SNP基因分型实验对小鼠进行检测后发现:5个近交系小鼠核心群的变异位点数目要低于生产群，这与核心群严格控制繁殖代数使其整体扩繁代数要低于生产群有关。而对于新出现欲保留的亚系应及时配纯并建立详细档案资料。
　　4、通过SNP基因分型实验检测到存在于BALB/c Nude小鼠中的7个位点与其背景小鼠相比发生变异。进一步对X免疫缺陷小鼠的检测发现在rs13478215位点与其背景小鼠相比发生变异。这说明SNP整体的多态性要比微卫星高，对遗传变异的检测更为敏感。这些突变位点很可能与相关的基因修饰间具有密切关系。这为阐明SNP的变异与相关基因修饰间的关系奠定了基础，同时也为新出现的基因修饰动物的遗传监测提供一种思路。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 近交系、封闭群、杂交群与免疫缺陷小鼠研究进展

1．1 近交系、封闭群、杂交群实验动物

1．2 相关免疫缺陷小鼠研究进展

2 遗传监测方法研究进展

2．1 传统的遗传检测方法

2．2 第二代遗传监测标记--微卫星研究进展

2．3 第三代遗传监测标记—SNP研究进展

第二章 研究论文

引言

1 实验材料与试剂

1．1 实验动物

1．2 实验试剂及仪器

2 实验方法

2．1 鼠尾全基因组DNA的提取

2．2 DNA的浓度测定及工作液制备

2．3 微卫星多态性PCR检测

2．4 SNP基因分型检测

3 实验结果

3．1 微卫星遗传监测体系建立

小结

3．2 采用SNP对8种小鼠品系进行遗传监测的研究

小结

讨论

结论

参考文献

附录

缩略语表

致谢

个人简历