XA21蛋白质的亚细胞定位及其定位决定结构域的鉴定

摘要

Xa21是一种抗水稻白叶枯病的基因，编码一个类受体蛋白激酶，在分子生物学和遗传育种方面具有重要的研究价值，它的蛋白产物XA21的亚细胞定位是整个研究体系的重要内容。 XA21蛋白质从C-端到N-端，主要由丝/苏氨酸激酶区(STK)、跨膜区(TM)、富亮氨酸重复区(LRR)和N-末端信号肽区(PSS)等结构域构成，推断认为，跨膜区或者连同信号肽一起可能对XA21蛋白质的亚细胞定位起决定作用。本研究采用融合绿色荧光蛋白标签法，确定XA21蛋白质的亚细胞定位并鉴定对定位起决定作用的结构域。 本试验根据Xa21的序列克隆了5个目的基因片段，从大到小依次命名为，Xa21FL(完整的Xa21cDNA*克隆)、Xa212115、Xa211971、Xa211911、Xa21381，物理大小分别是3126bp、2115bp、1971bp、1911bp、381bp。它们的5'-末端都是从Xa21cDNA*的起始密码子ATG开始、3'-末端逐次缺失那些被认为是重要结构域的基因编码区。所有克隆都包含有48bp的c-Myc及衔接头序列，Xa21FL就是在原Xa21cDNA的序列中加入了c-Myc序列，因而标记为Xa21cDNA*，二者实际上完全相同。Xa21FL采用重组PCR方法去除中间一段内元拼接两段外元而获得。就上述克隆片段对应的表达产物而言，除XA21全蛋白外，其余4个蛋白质自C-末端起逐次缺失丝氨酸/苏氨酸激酶区(STK)、跨膜区(TM)、富亮氨酸重复区(LRR)小部分、富亮氨酸重复区绝大部分。将克隆的5个目的基因片段融合在GFpS65T(Ser65用Thr替代)编码序列的5'-端，构建融合GFPS65T蛋白基因的表达载体，连同对照的GFPS65T蛋白基因载体pGFPS65T，通过基因枪转化洋葱表皮细胞，培养24小时～48小时，用激光共聚焦显微镜检测法采集荧光图像，进行定位分析。由此，本试验得到以下结果： 1.采用重组PCR方法克隆了Xa21FL(Xa21cDNA*)；2.构建了5个融合目标基因片段的GFPS65T蛋白基因表达载体，pXa21381-GFPS65T，pXa211911-GFPS65T，pXa211971-GFPS65T，pXa212115-GFPS65T，pXa21FL-GFPS65T； 3.荧光图像定位分析表明，对照的荧光在整个细胞中都有分布，证明GFPS65T没有细胞分布的特定倾向，不会对融合蛋白的定位产生影响；XA21融合全蛋白荧光集中在质膜上，从而亚细胞定位XA21蛋白质在质膜上； 4.用反差法检验相应结构域缺失后的融合荧光蛋白定位与XA21融合荧光全蛋白的差异，借助差异分析鉴定对全蛋白定位起决定作用的结构域，发现缺失不同结构域的融合蛋白均在质膜、细胞核或者其它部位表达荧光。通过与全蛋白定位结果比较，表明XA21蛋白的正确亚细胞定位必须保持完整的全蛋白状态，而不是由预测的跨膜区或者信号肽的独立结构域所决定的。

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1引言

2材料与方法

3结果与分析

4讨论

5结论

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