板蓝根根腐病病原菌鉴定及抑菌中草药提取物的筛选

摘要

近年来，板蓝根根腐病在一些产区发生逐年加重，成为板蓝根生产的限制因素之一。本文以板蓝根根腐病为研究对象，进行了病原菌的分离、致病性测定、种类鉴定、生物学特性研究以及抑菌中草药提取物的筛选试验。 分别于2005年7月和2006年7月，从河北省唐山地区共采集108个板蓝根根腐病样品，分离获得172株分离物。按照柯赫氏法则，经形态学鉴定分别属于2属3个种：茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和禾谷丝核菌(Rhizoctonia cer4ealis)。三者的分离频率依次为48.8％，44.2％和7％。 为了进一步确定病原菌的分类地位，本研究对菌株P1、P2、P4和P5进行了ITS序列分析。结果表明：菌株P1与GenBank中尖孢镰刀菌(DQ459007)的同源性为100％，P2与禾谷丝核菌(AJ242887)同源性为100％，P4与茄腐镰刀菌(AY310442)的同源性为99％，P5与茄腐镰刀菌(AJ608989)的同源性为100％。 对P1、P2、P4和P5供试4个菌株在不同温度、pH值、碳源、氮源、相对湿度条件下的菌落生长、产孢量、孢子萌发以及致死温度研究的结果表明，菌株P1在PDA培养基上菌落生长、产孢量和孢子萌发最适温度均为25℃，菌落生长和分生孢子萌发最适pH值均为6，产孢最适pH值为5，最适碳源为蔗糖，最适氮源为硝酸钠，在相对湿度低于90％时孢子不萌发，分生孢子致死温度为55℃。菌株P2在PDA培养基上最适生长温度为30℃，在pH值为6时生长速度最快，最适碳源为淀粉，最适氮源为硝酸钠。菌株P4、P5在PDA培养基上菌落生长和产孢最适温度均为30℃，孢子萌发最适温度为25℃，菌落生长、产孢和分生孢子萌发最适pH值均为7，最适碳源为乳糖，最适氮源为硝酸钠，相对湿度低于90％孢子不萌发，分生孢子致死温度为50℃。 以菌株P4为靶标菌，测试了123种中草药提取物对菌落生长及分生孢子萌发的抑制作用。结果表明，提取物浓度为10 mg/mL时，有99种提取物对菌落生长具有显著的抑制作用，其中TS-10、TS-42和TS-84的抑制率均大于50％，而且TS-10的抑制率达到了100％；有112种提取物对分生孢子萌发具有显著的抑制作用，其中10种提取物的抑制率在50％以上，而且TS-10和TS-11的抑制率达到100％。将抑制率大于50％的10种提取物稀释为5 mg/mL，进行二次筛选，发现TS-42和TS-84两种提取物对菌落生长的抑制作用下降，而TS-10对菌落生长抑制率仍为100％，对分生孢子萌发抑制率为为74.50％。TS-10的抑制中浓度(EC<,50>)为3.621 mg/mL。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1板蓝根分类地位

1.2板蓝根根腐病发生概况

1.3植物根腐病病原菌

1.4镰刀菌的分类研究

1.5丝核菌的分类研究

1.6 ITS序列在真菌鉴定中的应用

1.7植物源杀菌剂的研究概况

1.8本研究的目的与意义

2材料和方法

2.1试验材料及仪器

2.1.1板蓝根根腐病样品采集

2.1.2供试培养基

2.1.3供试试剂

2.1.4仪器设备

2.2板蓝根根腐病菌的分离、纯化

2.3分离物致病性测定

2.3.1寄主植物的准备

2.3.2接种物的准备

2.3.3接种方法

2.3.4病害统计方法

2.4板蓝根根腐病菌的形态鉴定

2.4.1镰刀菌鉴定

2.4.2丝核菌鉴定

2.5板蓝根根腐病菌的ITS序列分析

2.5.1菌丝体培养及收集

2.5.2 DNA提取

2.5.3琼脂糖凝胶电泳检测

2.5.4 rDNAITS片段的PCR扩增

2.5.5 PCR扩增产物的纯化

2.5.6感受态细胞的制备

2.5.7 DNA片段的克隆

2.5.8转化菌落的转种培养及阳性克隆的检测

2.5.9ITS片段的测序及序列分析

2.6病原生物学特性研究

2.6.1不同温度对菌落生长、产孢量和孢子萌发的影响

2.6.2不同pH值对菌落生长、产孢量和孢子萌发的影响

2.6.3不同碳源对菌落生长及产孢量的影响

2.6.4不同氮源对菌落生长及产孢量的影响

2.6.5相对湿度对分生孢子萌发的影响

2.6.6分生孢子致死温度的测定

2.7对板蓝根根腐病菌有抑制作用的中草药提取物的筛选

2.7.1供试中草药

2.7.2中草药提取物的制备

2.7.3中草药提取物的初步筛选

2.7.4中草药提取物的二次筛选及抑菌中浓度的测定

3结果与分析

3.1病原菌分离结果

3.2分离物的致病性测定

3.3板蓝根根腐病菌的形态鉴定

3.3.1镰刀菌形态鉴定

3.3.2丝核菌形态鉴定

3.4ITS序列分析

3.4.1 DNA的检测

3.4.2ITS片段的扩增

3.4.3扩增产物的纯化

3.4.4 DNA片段的克隆

3.4.5 4个菌株的ITS序列分析

3.5板蓝根根腐病菌生物学特性研究

3.5.1温度对菌落生长、产孢量及孢子萌发的影响

3.5.2 pH值对菌落生长、产孢量和孢子萌发的影响

3.5.3碳源对菌落生长及产孢量的影响

3.5.4氮源对菌落生长和产孢量的影响

3.5.5相对湿度对菌株P1、P4和P5分生孢子萌发的影响

3.5.6分生孢子致死温度测定

3.6中草药提取物对菌落生长和孢子萌发的影响

3.6.1中草药提取物抑菌活性的初步筛选

3.6.2抑菌活性大于50％的中草药提取物的二次筛选

3.6.3 TS-10提取物抑菌中浓度的测定

4讨论

4.1板蓝根根腐病与病原菌鉴定

4.2接种技术

4.3核糖体DNAITS序列在真菌鉴定中的应用

4.4板蓝根根腐病菌的生物学特性

4.5抑菌中草药提取物的筛选

5 结论

5.1板蓝根根腐病的病原

5.2回接方法的研究

5.3生物学特性研究

5.4中草药提取物的筛选

参考文献

在读期间发表的学术论文

发表论文一

发表论文二

作者简历

致谢