绿脓杆菌ATCC27853菌株外毒素A全长编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

摘要

目的:绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是重要的人畜共患病原菌。绿脓杆菌感染可发生在人体任何部位和组织，引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症；在幼小畜禽中往往大群暴发，常与大肠杆菌混合感染，或者是出壳雏鸡接种马立克氏病疫苗造成绿脓杆菌严重感染，1～2天内死亡达70％～80％。绿脓杆菌能产生多种与毒力有关的物质，其中绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PEA)是一种致死性外毒素，是绿脓杆菌最主要的致病因子。人们已经对PEA的结构与作用机制有一定的研究，在此基础上，人们利用基因工程技术将它改造为具有医疗用途的蛋白质:利用PEA的细胞毒性作用制成免疫毒素，作为治疗癌症的药物；利用PEA很好的免疫原性制备防治绿脓杆菌感染的基因工程疫苗或将PEA作为蛋白疫苗佐剂和疫苗载体，可以大大提高免疫原性；利用PEA能够携带蛋白质或DNA进入细胞中的特殊功能，将其应用于基因治疗。PEA的上述重要的临床应用一直刺激着对PEA.的分子结构和功能的研究。然而绿脓杆菌菌株多，毒力差异大，GeneBank已发表的全长PEA序列只有三个(K01397，strain PA103；AE00409l，strain PA01；CP000438，strain UCBPP-PA14)，Blast分析结果显示它们的PEA碱基序列与氨基酸序列均存在着差异。研究不同菌株间PEA结构和PEA蛋白生物活性的差异可以揭示PEA结构与细胞毒性及免疫原性的关系，从而使PEA更好的应用于免疫毒素、疫苗方面和基因治疗。因此本实验拟克隆绿脓杆菌产毒株ATCC27853的PEA全长编码基因序列，以提供素材用于PEA结构的比较研究。本实验也对克隆的PEA基因进行了序列分析，并构建其真核表达载体pcDNA3.1A/PEA，将其转染人肾胚胎上皮细胞-HEK293T细胞，实现了PEA基因在真核细胞中的分泌性表达，以便今后进一步研究PEA结构与细胞毒性和免疫原性的关系，从而为PEA的细胞毒性和免疫原性在免疫毒素、疫苗和基因治疗方面的应用奠定基础。 方法：本研究根据GeneBank已发表的绿脓杆菌标准毒株PA103序列设计1对特异性引物，从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853菌株中提取细菌基因组DNA，以此为模板，用PCR方法扩增绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosaexotoxin A, PEA)全长编码基因，利用pMD18-T载体构建PEA的克隆载体pMD18-T/PEA，经过蓝白斑筛选，限制性内切酶Hind Ⅲ和Xba I双酶切鉴定和PEA基因内部的Kpn I单酶切鉴定后，进行PEA基因序列测定。将测序结果与GeneBank已发表的PA103菌株的序列进行比对，确定克隆的基因确是绿脓杆菌ATCC27853菌株PEA全长编码基因后，将PEA亚克隆入pcDNA3.1A真核表达载体，用克隆位点的Hind Ⅲ和Xba I以及PEA基因内部的Apa I对重组质粒pcDNA3.1A/PEA进行酶切鉴定。为鉴定带有原信号肽(原核生物信号肽)的PEA基因能否在真核细胞中表达，本研究用真核表达载体pcDNA3.1A/PEA转染人肾胚胎上皮细胞-HEK 293T细胞，同时用pcDNA3.1A空载体转染HEK 293T细胞作为阴性对照。通过多次试验建立了磷酸钙方法瞬时转染HEK293T细胞的真核细胞表达系统。用Western blot方法检测PEAl的表达。 结果:以基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增PEA基因后，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到1条符合预期片段大小的特异性片段，即1914 bp。将PCR产物连接到pMD18-T载体上，经酶切鉴定正确后，把重组质粒pMD18-T/PEA送公司测序。将测序结果与GeneBank已发表的PA103菌株的序列进行比对，确定本实验克隆的基因确是绿脓杆菌ATCC27853菌株PEA全长编码基因。将PEA基因亚克隆入pcDNA3.1A真核表达载体，酶切重组质粒进行鉴定，电泳结果符合预期片段大小。结果证明pcDNA3.1A/PEA真核表达载体构建成功。将重组质粒pcDNA3.1A/PEA转染真核细胞HEK293T细胞，Western blot检测结果显示在分子量约为130 KDa处有一条明显的杂交带，而空载体在相应位置未见杂交带。 结论:从绿脓杆菌ATCC27853菌株基因组DNA中扩增出PEA全长编码基因；序列分析发现绿脓杆菌ATCC27853菌株与标准毒株PA103的基因序列和氨基酸序列均存在着差异，同源性均达99％；成功构建了PEA基因的真核表达载体pcDNA3.1A/PEA，并将其转染真核细胞，实现了它在真核细胞中的分泌性表达，以便今后进一步研究PEA结构与细胞毒性和免疫原性的关系，从而为PEA的细胞毒性和免疫原性在免疫毒素、疫苗和基因治疗方面的应用奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

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注释

1引言

1.1绿脓杆菌

1.2绿脓杆菌外毒素A

1.2.1 PEA的分子结构

1.2.2 PEA的细胞毒作用机制

1.2.3目前PEA在医疗上的用途

1.3研究目的与意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1菌株、载体和细胞

2.1.2主要试剂

2.1.3培养基及溶液的配制

2.1.4主要仪器

2.2方法

2.2.1 PEA基因的PCR扩增

2.2.2 PEA基因克隆载体pMD18-T/PEA的构建(图5)

2.2.3 DNA序列测定与分析

2.2.4 PEA基因真核表达载体pcDNA3.1A/PEA的构建(图5)

2.2.5重组质粒pcDNA3.1A/PEA在真核细胞中的表达

3结果和分析

4讨论

5结论

6参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

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致谢