LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌

摘要

食品是人类赖以生存和发展的基础。随着经济的不断发展，人们生活水平的不断提高，食品安全越来越得到人们的广泛关注。这与食品安全事件频发有很大关系，在这些食品安全事件中，很大一部分是由细菌性食物中毒引起的。小肠耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)是一种重要的人畜共患病病原菌，在自然界中分布十分广泛，并且它不怕低温，是能在冷藏温度下生长的少数几种肠道致病菌之一。可引起胃肠道症状，引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等疾患，发病范围较其它致病菌广泛，甚至可引起败血症造成死亡。由于该菌属于重要的食源性致病菌，所以该菌被列为检测进出口食品的常规菌种，多个国家均列入检测范围。
　　 检测食品中的致病菌常采用传统的手工检测方法，涉及到富集、分离培养、形态观察、生理生化反应等多项实验，程序极其繁琐，且耗时较长，还无法检测那些人工难以培养的微生物。与之相比，该菌的快速检测方法更为灵敏，也更适用于日常生活中的检测。其中环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)最具有代表性，该方法是一种新型体外扩增核酸的技术，具有简便、强特异性、高灵敏度等优点，已经用于检测致病菌。
　　 本论文研究利用小肠耶尔森氏菌ail基因作为目标基因，充分利用应用在线引物设计软件进行设计，选出一套LAMP引物，用环介导等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌。对反应体系和条件进行优化，确定25μL反应体系为:10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5μL，dNTPs、MgC12各2.0μL，内引物FIP和BIP各3.0μL，外引物F3和B3各0.5μL，8 U/μL的Bst DNA聚合酶0.6μL， DNA模板2μL，灭菌水补足25μL体系。反应在63℃恒温水浴锅中反应60 min，后在80℃恒温水浴锅中反应5 min使Bst DNA聚合酶失活以使反应终止，实验结果为:通过直接观察，看有无白色焦磷酸镁沉淀生成，从而初步判断反应是否发生，若发生，则通过琼脂糖凝胶电泳进一步验证其结果。
　　 本研究共检测了10株菌，结果显示:1株小肠结肠炎耶尔森氏菌为阳性;其它菌均为阴性结果，试验结果表明引物特异性强。本方法确定了检测该菌的灵敏度、人工污染检出限，并且与普通的PCR检测方法做了比较。LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为101 CFU/mL，受到人工污染的猪肉样品的检出限为102 CFU/mL。检测该菌的灵敏度和人工污染检出限，均高于PCR检测方法。比较了4种人工污染猪肉中模板DNA提取方法，选取了一种快捷、高效的DNA提取方法。整个反应从模板提取到反应结束耗时4h，大大缩短了检测时间。
　　 该研究应用LAMP法检测食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌，此检测方法具有很强的特异性、较高的灵敏度，简便、快速、经济。该检测方法操作简单，仪器设备要求不高，简单的恒温水浴锅即可发生，更适用于中小企业及基层食品检验部门的日常检测需求。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 实验的背景及研究意义

1．2 小肠结肠炎耶尔森氏菌的简介

1．2．1 小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物学特征

1．2．2 小肠结肠炎耶尔森氏菌的流行病学特征

1．2．3 小肠结肠炎耶尔森氏菌血清型

1．3 小肠结肠炎耶尔森氏菌研究现状

1．3．1 传统的生化鉴定法

1．3．2 PCR检测方法

1．4 环介导等温扩增(LAMP)技术

1．4．1 LAMP法的概述

1．4．2 LAMP法的基本原理

1．4．3 LAMP法的引物设计

1．4．4 LAMP反应产物的检测方法

1．4．5 LAMP法的特点

1．5 研究内容

2 材料与方法

2．1 试验材料与仪器

2．1．1 试验菌株

2．1．2 仪器与设备

2．1．3 主要培养基

2．1．4 样品与生化试剂

2．2 试验方法

2．2．1 菌种的培养

2．2．2 细菌DNA模板的提取

2．3 LAMP反应引物设计

2．4 LAMP方法的建立

2．5 反应条件优化

2．5．1 引物对LAMP反应的影响

2．5．2 Mg2+添加量优化

2．5．3 dNTPs添加量优化

2．5．4 反应温度的优化

2．5．5 Bst酶的优化

2．6 LAMP引物特异性实验

2．7 LAMP检测与PCR检测小肠结肠炎耶尔森氏菌灵敏度的比较

2．7．1 LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度

2．7．2 PCR检测的灵敏度

2．8 人工污染猪肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组DNA提取方法的比较

2．8．1 热裂解法

2．8．2 化学试剂法

2．8．3 试剂盒法

2．8．3 蛋白酶K法

2．9 人工污染猪肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌检出限试验

3 结果与分析

3．1 LAMP反应体系的建立

3．2 LAMP反应条件的优化

3．2．1 引物对LAMP反应的影响

3．2．2 Mg2+添加量的优化

3．2．3 dNTPs添加量的优化

3．2．4 反应温度的优化

3．2．5 Bst酶的优化

3．3 LAMP引物特异性实验

3．4 LAMP检测与PCR检测小肠结肠炎耶尔森氏菌灵敏度的比较

3．4．1 LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度

3．4．2 PCR检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度

3．5 猪肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌基因组DNA提取的方法比较

3．6 人工污染猪肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出限

4 讨论

4．1 靶基因的选择与引物的设计

4．2 LAMP反应体系的优化

5 结论

参考文献

个人简历

致谢