中药射干及葛花主要活性成分鸢尾黄素的提取分离与微生物转化

摘要

鸢尾苷和野鸢尾苷等异黄酮是中药射干的主要活性成分，葛花苷、次葛花苷、鸢尾黄素、鸢尾苷以及尼泊尔鸢尾异黄酮等是中药葛花的主要活性成分。将中药射干甲醇提取物或中药葛花甲醇提取物进行酸水解后均可得到鸢尾黄素。
　　 通过本研究发现，耐氧突变株Sharpeasp.strainAeroto-Niu-O16在有氧条件下能将底物鸢尾黄素（tectorigenin）进行转化。根据产物的质谱及核磁共振氢谱和碳谱等测定结果，将菌株转化鸢尾黄素所生成的产物鉴定为二氢鸢尾黄素（dihydrotectorigenin，简称DHT）。耐氧突变株Aeroto-Niu-O16对底物鸢尾黄素粗品的最大转化浓度为0.8mmol/L，平均转化率为41.2％;当向培养基中添加0.15％(m/v)的L-半胱氨酸时，底物鸢尾黄素的平均转化率可由原来的41.2％提高到50.7％。利用微生物转化法将鸢尾黄素转化为还原产物DHT尚属国内外首次报道。
　　 由于耐氧突变株Sharpeasp.strainAeroto-Niu-O16对鸢尾黄素转化率较低，我们从公鸡新鲜粪样中重新分离得到一株在厌氧条件下能将鸢尾黄素高效还原为DHT的革兰氏阳性严格厌氧细菌AUH-JLC39(KC523278)。通过BLAST比对，菌株AUH-JLC39与梭菌属菌株Clostridiumsp.TM40(AB249652)亲缘关系最近，其16SrDNA序列相似性为99.7％，但与其它梭菌属菌株的相似性均低于90％。因而，将该转化菌株鉴定为梭菌属的一个新分类单元。当底物鸢尾黄素浓度低于0.6mmol/L时，菌株AUH-JLC39能将加入到培养基中的底物鸢尾黄素全部还原为产物DHT;当底物浓度为0.8mmol/L和1.0mmol/L时，菌株AUH-JLC39对鸢尾黄素的平均转化率分别为94.2％和90.5％;当所加入的底物浓度为1.2mmol/L时，菌株AUH-JLC39对底物鸢尾黄素粗品转化能力急剧下降，平均转化率降低为67.1％。经转化动态研究发现，当底物与菌共培养6小时后即有39.5％的底物鸢尾黄素被转化，共培养12小时后有81.8％的底物鸢尾黄素被转化。
　　 通过测定底物和产物对二苯代苦味酰基自由基(DPPH)体外清除能力发现，当检测浓度在0.25mmol/L到1.0mmol/L范围内时，相同浓度下产物DHT对DPPH的清除率均极显著高于底物鸢尾黄素(p＜0.01);此外，还发现在该浓度范围内，相同浓度的底物鸢尾黄素对DPPH自由基的清除率极显著高于具有较高抗氧化活性的黄豆苷原微生物代谢产物雌马酚(p＜0.01)。相同浓度下产物DHT具有远高于底物鸢尾黄素以及雌马酚的抗氧化活性尚属国内外首次报道。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 中药射干、葛花及其各主要活性成分

1．2 鸢尾黄素结构及其生物学功能

1．2．1 鸢尾黄素的化学结构

1．2．2 鸢尾黄素生物学功能

1．3 鸢尾黄素微生物转化国内外研究现状

1．4 研究意义及创新点

1．4．1 研究意义

1．4．2 创新点

第二章 中药射干及葛花中主要活性成分鸢尾黄素的提取分离及结构鉴定

2．1 材料

2．1．1 试验材料

2．1．2 试剂

2．1．3 主要试验仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 射干及葛花的预处理

2．2．2 射干及葛花活性成分的粗提取

2．2．3 射干及葛花甲醇粗提物酸水解

2．2．4 高效液相色谱条件

2．2．5 酸水解产物结构鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 射干中主要活性成分的提取分离及结构鉴定

2．3．2 葛花中主要活性成分的提取分离及结构鉴定

第三章 耐氧突变株Aeroto-Niu-O16对鸢尾黄素的转化研究

3．1 材料

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 药品与试剂

3．1．4 主要试验仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．1 高效液相色谱条件

3．2．2 鸢尾黄素代谢产物的分离纯化

3．2．3 鸢尾黄素代谢产物的结构鉴定

3．2．4 鸢尾黄素的转化动态

3．2．5 菌株Aeroto-Niu-O16对鸢尾黄素的最大转化能力测定

3．2．6 不同还原剂对菌株Aeroto-Niu-O16转化活性的影响

3．3 结果与分析

3．3．1 鸢尾黄素代谢产物的高效液相色谱分析

3．3．2 鸢尾黄素代谢产物的质谱以及核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)

3．3．3 菌株Aeroto-Niu-O16对底物鸢尾黄素的转化动态

3．3．4 菌株Aeroto-Niu-O16对底物鸢尾黄素最大转化能力测定

3．3．5 不同还原剂对菌株Aeroto-Niu-O16转化活性的影响

3．4 讨论

第四章 鸡肠道鸢黄素转化菌株的分离筛选与鉴定

4．1 材料

4．1．1 样品来源

4．1．2 筛选培养基

4．1．3 药品与试剂

4．1．4 主要试验仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．1 鸢尾黄素转化菌的分离筛选

4．2．2 菌株革兰氏染色及耐氧性测定

4．2．3 所分离菌株的纯化培养与保藏

4．2．4 筛选菌株的16S rDNA序列测定

4．3 结果与分析

4．3．1 鸢尾黄素转化菌株的分离筛选

4．3．2 菌株AUH-JLC39的菌落及菌体形态特征

4．3．3 菌株AUH-JLC39革兰氏染色与耐氧特性

4．3．4 菌株AUH-JLC39 16S rDNA序列分析

4．4 结论

第五章 菌株AUH-JLC39对鸢尾黄素的转化研究

5．1 材料

5．1．1 菌株

5．1．2 培养基

5．1．3 药品与试剂

5．1．4 主要试验仪器与设备

5．2 试验方法

5．2．1 鸢尾黄素代谢产物的分离纯化

5．2．2 鸢尾黄素代谢产物的结构鉴定

5．2．3 鸢尾黄素的转化动态

5．2．4 菌株AUH-JLC39对鸢尾黄素的最大转化能力测定

5．3 结果与分析

5．3．1 鸢尾黄素代谢产物的高效液相色谱分析

5．3．2 鸢尾黄素代谢产物的质谱及核磁共振氢谱和碳谱分析

5．3．3 菌株AUH-JLC39对底物鸢尾黄素的转化动态

5．3．4 菌株AUH-JLC39对底物鸢尾黄素最大转化能力测定

5．4 结论

第六章 底物鸢尾黄素及其代谢产物体外抗氧化能力比较

6．1 材料

6．1．1 药品与试剂

6．1．2 主要试验仪器与设备

6．2 试验方法

6．2．1 DPPH反应体系稳定性及最佳反应时间测定

6．2．2 DPPH自由基体外清除能力测定

6．2．3 统计分析

6．3 结果与分析

6．3．1 DPPH反应体系的稳定性及最佳反应时间测定

6．3．2 底物鸢尾黄素及其代谢产物体外抗氧化能力比较

6．4 结论

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢