绵羊早孕因子蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

摘要

早孕因子（Early pregnancy factor，EPF）是目前在哺乳动物妊娠早期血清中发现的最早的与妊娠相关的免疫抑制因子和生长调节因子，其可检测时间远远早于人绒毛膜促性腺激素(HCG)，并且早孕因子对妊娠母体具有很高的特异性，对早孕因子检测方法的开发与应用对于畜牧生产具有重要意义。
　　目的:应用原核表达技术制备早孕因子蛋白，将其与弗氏佐剂混合后对家兔进行免疫，制备抗早孕因子多克隆抗体，为进一步研究开发早孕因子检测试剂盒奠定基础。
　　方法:以妊娠绵羊卵巢组织为样本提取总RNA，反转录得到单链cDNA，通过PCR扩增分别得到带有EcoRⅠ与XhoⅠ酶切位点和NcoⅠ与XhoⅠ酶切位点的两条绵羊早孕因子编码基因。然后进行TA克隆，双酶切反应，经T4连接酶分别与表达载体pGEX-4T-1与pET20b重组，并转化表达菌株BL21(DE3)感受态。在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导下，表达产生融合GST标签与His标签的早孕因子蛋白。通过GST亲和吸附层析柱与Ni亲和吸附层析系统得到融合蛋白纯品，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析重组蛋白的表达。使用纯化得到的融合GST标签的早孕因子蛋白与弗氏佐剂按等比例混匀后，免疫家兔制备早孕因子多克隆抗体。以融合His标签的早孕因子蛋白为包被原，通过间接ELISA法测定抗体效价，并通过Western Blot试验检测血清抗体对早孕因子蛋白的识别、结合能力。通过临床试验检测20只绵羊妊娠情况，进行血清抗体实际应用验证。
　　结果:大肠杆菌原核表达得到的早孕因子融合GST标签的早孕因子蛋白分子量约为36 kDa，融合His标签的早孕因子蛋白分子量约为12 kDa，与理论值相符。两种重组早孕因子融合蛋白在大肠杆菌中确实得到了高效表达和理想的纯化效果，免疫家兔57 d后血清抗体滴度达到了1∶12000，血清抗体能够识别早孕因子蛋白，并且血清抗体实际检测应用检测正确率达95％。早孕因子重组子在大肠杆菌中得到了丰富表达，制备的早孕因子多克隆抗体具有良好的生物活性与特异性。

目录

声明

论文说明

摘要

缩略词(Abbreviations)

1 引言

1．1 早孕因子的来源

1．2 早孕因子的本质及生物学特性

1．3 早孕因子的生物学作用

1．3．1 免疫抑制调节作用

1．3．2 生长调节中的作用

1．4 早孕因子的应用

1．4．1 超早孕检测

1．4．2 胚胎监控

1．4．3 肿瘤细胞的早期诊断

1．4．4 其他方面的应用

1．5 早孕因子分离纯化

1．6 早孕因子的检测

1．7 早孕因子的应用前景

1．8 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 实验动物与主要试剂

2．1．3 主要溶液配制

2．2 实验步骤

2．2．1 总RNA的提取和检测

2．2．2 反转录合成cDNA

2．2．3 目的基因扩增

2．2．4 目的基因的克隆

2．2．5 PCR鉴定TA克隆

2．2．6 酶切鉴定TA克隆

2．2．7 TA克隆基因测序

2．2．8 目的基因与表达载体双酶切

2．2．9 切胶回收

2．2．10 目的基因与表达载体连接

2．2．11 表达重组子PCR鉴定

2．2．12 表达重组子酶切鉴定

2．2．13 表达重组子基因测序

2．2．14 表达重组质粒转化表达感受态

2．2．15 蛋白表达与检测

2．2．16 蛋白纯化

2．2．17 透析袋的使用预处理

2．2．18 免疫动物

2．2．19 抗体滴度检测

2．2．20 多克隆抗体特异性检测

2．2．21 绵羊妊娠检测多克隆抗体

3 结果与分析

3．1 目的基因的获得

3．2 TA克隆重组质粒PCR鉴定

3．3 TA克隆重组质粒酶切结果

3．4 表达重组子PCR鉴定结果

3．5 表达重组子酶切鉴定结果

3．6 测序结果

3．7 Western Blot结果

3．8 绵羊EPF抗血清效价检测

3．9 抗体特异性鉴定

3．10 羊妊娠检测

4 讨论

4．1 早孕因子蛋白的制备

4．2 多克隆抗体的制备

4．3 展望

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢