猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

摘要

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，该病对全世界养猪业造成了重大经济损失。目前，实验室常用的检测PEDV的方法有RT-PCR和ELISA等，但由于其需要专业人员和昂贵的仪器设备而在临床使用中受到限制。实时荧光逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）具有快速、灵敏等优点，目前国内外尚无检测PEDV的实时荧光RT-LAMP检测方法。
　　本研究从保定某发病猪场采集疑似PEDV的粪便样本，将处理好的样本接种Vero细胞，盲传至第五代时，细胞开始出现明显的CPE，通过RT-PCR及测序结果证实该分离毒为PEDV，命名为HB-LX株。利用该毒株，根据GenBank中已登录的PEDV基因序列，在其N基因保守区域设计了6条实时荧光RT-LAMP引物，利用ESE-QuantTube Scanner检测系统，对实时荧光RT-LAMP内外引物的浓度比，镁离子、dNTPs、Bst DNA聚合酶、螯合剂的浓度进行了优化。结果显示，25μL反应体系中，固定外引物F3、B3的量各为0.5μL，当外引物与内引物的量为1∶4，螯合剂的量为1.0μL，Bst DNA聚合酶的量为0.5μL，Mg2+的量为1.0μL，dNTPs的量为5.0μL时，62℃，反应1hr，扩增效果良好。利用优化的反应体系与条件进行了特异性和灵敏性试验。结果表明，该检测方法特异性好，敏感性是RT-PCR的10倍。60份临床样品检测表明，实时荧光RT-LAMP对临床样品的阳性检出率为93％，高于RT-PCR。
　　本研究建立了PEDV实时荧光RT-LAMP检测方法，该方法可在恒温条件下(62℃)1hr完成RT和LAMP扩增，特异性强，敏感性高，而且结果判定简单，无需电泳即可实现肉眼可见的扩增效果，可用于基层或现场疫病诊断。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 PEDV的研究现状

1．1．1 病原学

1．1．2 流行病学

1．1．3 临床症状与致病机理

1．1．4 实验室检测技术

1．2 环介导等温扩增技术(LAMP技术)

1．2．1 LAMP技术的概述

1．2．2 LAMP技术的基本原理

1．2．3 LAMP产物的检测

1．2．4 LAMP技术的应用

1．3 实时荧光RT-LAMP及其应用

1．4 研究内容

1．4．1 PEDV流行株分离与鉴定

1．4．2 PEDV实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

1．5 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病料、毒株及细胞

2．1．2 主要仪器

2．1．3 实验所需主要试剂

2．1．4 试验所需主要溶液及其配制

2．1．5 引物的设计与合成

2．2 方法

2．2．1 PEDV流行株分离与鉴定

2．2．2 PEDV实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

3 结果

3．1 PEDV流行株分离与鉴定

3．1．1 PEDV流行株分离培养

3．1．2 细胞毒的RT-PCR检测结果

3．1．3 PEDV S基因的RT-PCR扩增

3．1．4 PEDV S基因同源性分析

3．1．5 PEDV S基因遗传进化树分析

3．2 猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

3．2．1 PEDV实时荧光RT-LAMP扩增反应结果

3．2．2 PEDV实时荧光RT-LAMP扩增产物的酶切鉴定

3．2．3 PEDV实时荧光RT-LAMP扩增反应条件的优化

3．2．4 PEDV实时荧光RT-LAMP检测方法的特异性检测

3．2．5 PEDV实时荧光RT-LAMP检测方法的敏感性检测

3．2．6 PEDV实时荧光RT-LAMP检测方法的重复性检测

3．2．7 PEDV实时荧光RT-LAMP检测方法的应用

4 讨论

4．1 PEDV流行株分离与鉴定

4．2 猪流行性腹泻病毒实时荧光RT-LAMP检测方法的建立

5 结论

参考文献

附录

作者简介

在校期间发表学术论文

致谢