重组鸡α干扰素全基因合成、原核表达及抗病毒活性测定

摘要

干扰素(Interferon，IFN)是在病毒感染的情况下，机体细胞所产生的一类多功能蛋白，进入血液循环到达全身，细胞内的抗病毒作用机制被激活合成各种抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵扰。目前一些禽类病毒性传染疾病仍然缺乏有效的防治手段，化学药物的使用容易产生耐药性，引起禽类体内药物残留而影响人类健康，疫苗的研制则需要考虑病毒的变异与多样性。与疫苗和化学药物相比，鸡源干扰素具有广谱、高效和无残留等优点，可有效的用于鸡病毒性传染病的预防与治疗。目前我国已有用于临床使用的鸡IFN-α，但仍然存在着表达量低、纯度不高和复性工艺复杂等问题，因此，本研究利用基因工程技术与蛋白质工程技术研制重组鸡IFN-α，优化其表达、纯化和复性方法，并研究其抗病毒活性，旨在为鸡IFN-α工业化生产和临床应用奠定基础。
　　根据GenBank上登录的鸡IFN-α的基因序列，除去信号肽部分，保留编码成熟蛋白的基因序列。在不改变氨基酸的条件下，按照大肠杆菌对密码子的偏爱性，利用在线分析软件检测其中所包含的稀有密码子，替换为大肠杆菌偏爱的密码子并初步预测鸡IFN-α的表达水平。将优化的基因连接到PUC57载体上并进行全基因合成。重组质粒PUC57-ChIFN-α与表达载体pET32a连接，转化到E.coli BL21细胞中。对重组鸡IFN-α成熟蛋白的诱导表达时间、诱导剂浓度和温度条件进行优化，经洗涤、变性、纯化和复性，获得了重组鸡IFN-α。利用微量细胞病变抑制法测定重组鸡IFN-α的抗病毒活性。经SDS-PAGE结果显示，重组鸡IFN-α在37℃，0.6mmol/mL的IPTG条件下，以包涵体的形式高效表达，目的蛋白表达量占总蛋白的28.9％，蛋白分子量约为32kD。经300mM咪唑洗脱纯化的目的蛋白，稀释与透析法相结合复性后，获得了纯度为95％的重组鸡IFN-α。经Western blot鉴定，重组蛋白与抗体之间，具有较好的反应原性，表明分子质量为32kD的蛋白即为目的蛋白。在鸡成纤维细胞上，重组鸡IFN-α抗VSV的活性为1.19×105U/mL，蛋白浓度为0.575mg/mL，比活性为2.07×105U/mg。
　　综上所述，本研究利用基因工程技术，优化了鸡IFN-α基因序列，构建了鸡IFN-α重组质粒，优化了重组鸡IFN-α表达、纯化和复性方法，获得了具有抗病毒活性的鸡IFN-α，为鸡病毒性传染病的防治提供了理论依据与技术支撑。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1．1 干扰素的研究概况

1．1．1 干扰素的分类及基因结构

1．1．2 干扰素的基本特性

1．1．3 干扰素产生的机理

1．1．4 干扰素的作用机制与信号通路

1．1．5 干扰素的生物学功能

1．1．6 鸡α干扰素的研究进展

1．1．7 重组鸡IFN-α的抗病毒效果

1．1．8 禽干扰素基因工程研究及应用

1．1．9 问题与展望

1．2 重组蛋白的表达、纯化和复性

1．2．1 表达系统和表达载体的选择

1．2．2 包涵体的溶解和蛋白纯化

1．2．3 包涵体蛋白复性原理

1．2．4 蛋白的体外折叠复性

1．3 研究内容与技术路线

1．3．2 技术路线

1．4 研究的目的及意义

2．1．1 质粒、毒株及细胞

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 试验所需主要溶液及其配制

2．1．5 鸡IFN-α优化后基因的引物序列设计

2．2 方法

2．2．2 全基因合成鸡IFN-α与表达载体pET-32a(+)的连接

2．2．3 全基因合成的重组鸡IFN-α成熟蛋白的原核表达

2．2．4 表达蛋白的可溶-J生分析

2．2．6 重组鸡IFN-α成熟蛋白的复性

2．2．7 蛋白的浓度和纯度测定

2．2．8 表达蛋白的Western blot鉴定

2．2．9 重组鸡IFN-α抗病毒活性的测定

3 结果与分析

3．1．2 鸡IFN-α基因序列优化前后CAI分析

3．2 重组质粒的双酶切鉴定

3．2．2 重组表达质粒pET32a-ChIFN-α的双酶切鉴定

3．3．1 最佳诱导时间的优化

3．3．2 最佳诱导IPTG浓度的优化

3．3．3 最佳诱导温度的优化

3．4 表达蛋白的可溶性分析

3．5．1 包涵体的变性

3．5．2 镍柱亲和层析纯化

3．6 重组鸡IFN-α成熟蛋白的复性

3．7 蛋白浓度和纯度的测定

3．8 表达蛋白的Western blot鉴定

3．9．2 微量细胞病变抑制法测定干扰素抗VSV活性结果

4．1 原核表达信号肽的去除

4．4 重组鸡IFN-α蛋白的原核表达

4．6 重组鸡IFN-α抗病毒活性的测定

5 结论

参考文献

附录

作者简介

致谢