重复经颅磁刺激对慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元的保护作用及其机制

摘要

背景：
　　抑郁症(Depression)是一种以显著而持久的情绪低落或兴趣丧失为主要特征，并伴有躯体症状、认知障碍、睡眠饮食障碍等的精神疾病。重复经颅磁刺激(repetitivetranscranial magnetic stimulation，rTMS)是一项被广泛应用于抑郁症治疗的新型神经电生理技术，其作用机制可能是通过多重途径直接或间接保护海马神经元，促进海马神经元再生、阻止海马神经元凋亡，达到产生抗抑郁效应的目的。本研究拟观察rTMS干预对慢性应激抑郁模型大鼠行为学水平和海马神经元形态的影响，以及对细胞凋亡蛋白Bax、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）表达水平的影响，探讨rTMS对慢性应激抑郁模型大鼠海马神经元的保护作用及其机制。
　　目的：
　　1.观察rTMS干预对慢性应激抑郁模型大鼠行为学水平和海马神经元形态的影响，研究rTMS干预对慢性应激抑郁模型大鼠的改善作用。
　　2.观察rTMS干预对慢性应激抑郁模型大鼠海马BDNF和Bax的表达水平的影响，探讨BDNF和Bax参与rTMS改善作用的可能机制。
　　方法：
　　1.将40只成年雄性SD大鼠经过初次筛选后，剔除评分离群系数较大的大鼠，其余大鼠按随机原则分为正常对照组(n=8)和造模组(n=30)。造模组大鼠抑郁模型的制备采用孤养联合慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)方法，经过行为学评估后将造模不成功的大鼠予以剔除，将剩余的大鼠分为三组:模型组（n=8，不给予任何处理）、rTMS组（n=8，给予10Hz的rTMS干预）和伪刺激组（n=8，模拟rTMS环境而没有rTMS刺激发出）。
　　2.rTMS干预:每天给予rTMS组大鼠频率为10Hz的rTMS干预，共10分钟，500个脉冲。每干预5天之后间隔2天，共21天。伪刺激组则置于相同的环境，线圈不通电，无脉冲发出。
　　3.模型抑郁状态的评估:测量并记录大鼠体重的变化;采用蔗糖水消耗试验观察大鼠的兴趣、快感以及对奖赏的反应性;运用旷场试验(open field test，OFT)检测大鼠的自主探索能力、自发运动能力以及紧张程度等，通过以上所得行为学数据共同评估模型的抑郁状态。
　　4.采用尼氏染色法观察大鼠海马区神经元以及尼氏小体的形态结构。
　　5.通过免疫组织化学法检测大鼠海马Bax、BDNF蛋白的表达水平，通过半定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法检测大鼠海马Bax、BDNFmRNA的表达水平。
　　6.采用独立样本t检验、单因素方差分析对实验数据进行统计分析，多重比较采用最小显著差检验（LST检验），检验水准α为0.05。
　　结果：
　　1.行为学评分结果:
　　造模前，大鼠总体体重分布满足正态分布，均质性较高;蔗糖水消耗量(t=1.674，P＞0.05)，旷场实验的水平运动距离（t=-1.590，P＞0.05）、垂直直立次数（t=-1.218，P＞0.05）、修饰次数（t=-1.998，P＞0.05）、排便次数（t=-0.855，P＞0.05）及中央格停留时间（t=1.076，P＞0.05）的差异均无统计学意义。
　　造模后，与对照组大鼠相比，造模组大鼠的体重减分率（t=4.114，P＜0.01），蔗糖水消耗量（t=-3.515，P＜0.01），旷场实验的水平运动距离(t=-6.482，P＜0.01)、垂直直立次数(t=-10.557，P＜0.01)、修饰次数（t=-11.632，P＜0.01）、排便次数（t=6.739，P＜0.01）及中央格停留时间(t=7.106，P＜0.01)均明显降低，差异具有统计学意义，提示造模成功。
　　rTMS干预后，四组大鼠的体重减分率（F=5.048，P＜0.01），蔗糖水消耗量(F=11.812，P＜0.01)，旷场实验的水平运动距离(F=13.594，P＜0.01)、垂直直立次数(F=67.667，P＜0.01)、修饰次数(F=44.452，P＜0.01)、排便次数(F=17.144，P＜0.01)及中央格停留时间(F=22.129，P＜0.01)之间的差异均有统计学意义。与对照组相比，模型组与伪刺激组大鼠的体重减分率，蔗糖水消耗量，旷场实验的水平运动距离、垂直直立次数、修饰次数、排便次数及中央格停留时间均显著低于对照组，差异具有统计学意义（均P＜0.01）;而与模型组相比较，rTMS组大鼠体重减分率，蔗糖水消耗量，旷场实验的垂直直立次数、水平运动距离、排便次数、修饰次数及中央格停留时间均明显高于模型组，差异具有统计学意义（均P＜0.01）;伪刺激组与模型组相比较，行为学的各项差异都没有统计学意义(均P＞0.05)。
　　2.尼氏染色结果:与对照组相比，模型组和伪刺激组大鼠海马CA3区神经元数目减少，排列较为紊乱，细胞形态较对照组差，尼氏小体数目有所减少;与模型组相比较，rTMS组大鼠海马CA3区神经元数目增多，排列较为紧密，细胞形态较模型组好转，尼氏小体数目增多。
　　3.免疫组织化学检测结果:四组大鼠海马各区Bax阳性蛋白计数(FCA1=29.377，FCA2=70.929，FCA3=36.551，FDG=23.412，P＜0.01)、BDNF阳性蛋白计数(FCA1=72.484，FCA2=110.640，FCA3=27.152，FDG=52.986，P＜0.01)差异有统计学意义。与对照组相比，伪刺激组和模型组大鼠海马各区BDNF阳性蛋白计数有明显降低、Bax阳性蛋白计数有明显增高，差异具有统计学意义（均P＜0.01）;与模型组比较，rTMS组大鼠海马各区Bax阳性蛋白计数均显著降低、BDNF阳性蛋白计数均明显升高，差异均具有统计学意义(均P＜0.01);伪刺激组与模型组比较，Bax阳性蛋白计数、BDNF阳性蛋白计数差异均无统计学意义(均P＞0.05)。
　　4.RT-PCR检测结果:四组大鼠海马Bax mRNA表达水平(F=37.545，P＜0.01)、BDNFmRNA表达水平(F=82.697，P＜0.01)差异有统计学意义。与对照组相比，模型组和伪刺激组大鼠海马Bax mRNA表达水平均显著增高、BDNF mRNA表达水平则明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01）;与模型组相比，rTMS组大鼠海马各区Bax mRNA表达水平显著降低、BDNF mRNA表达水平则明显增高，差异均具有统计学上的意义（均P＜0.01）;伪刺激组与模型组相比，Bax mRNA表达水平、BDNFmRNA表达水平差异均无统计学意义(均P＞0.05)。
　　结论：
　　1.rTMS干预可以显著改善慢性应激抑郁模型大鼠的抑郁样行为和海马神经元的形态。
　　2.rTMS干预的改善作用之一是通过对海马神经元的保护作用而实现的，其机制是增加BDNF的表达以促进海马神经元再生，减少Bax的表达以阻止海马神经元的凋亡。

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