Mir-20a-5p调控SDC2基因的表达提高耐药骨肉瘤细胞的化疗敏感性的研究

摘要

背景： 骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，化疗耐药是其治疗失败主要原因之一。阐明化疗耐药机制对骨肉瘤疗效的提升具有重要意义。微小RNA（miRNA）不仅与多种肿瘤的发生和发展密切相关，还与肿瘤化疗耐药的形成有关，但miRNA在骨肉瘤耐药中的作用与机制尚不清楚。 目的： 分析mir-20a-5p在骨肉瘤化疗药物耐受中的作用及分子机制。 方法： 1.依据RNA-Seq以及miR-omic组学分析，结合miRBase、CHIPBase和Targetscan三个数据库对mir-20a-5p的下游基因进行预测，寻找可能受到mir-20a-5p调控的靶向基因。 2.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹试验(western blot)技术检测骨肉瘤化疗敏感型细胞株G-292与骨肉瘤化疗耐受型细胞株SJSA-1细胞中mir-20a-5p和人多配体聚糖2（SDC2）的表达水平。 3.双荧光素酶报告检测mir-20a-5p可否与SDC2的3’-UTR结合，证明SDC2是否为mir-20a-5p的直接靶基因。 4.在SJSA-1细胞株中转染mir-20a-5p的mimic和si-SDC2，并在G292细胞株中转染mir-20a-5p的antagomir和GFP-SDC2。应用qRT-PCR验证，分析SDC2在细胞水平的表达是否受到mir-20a-5p mimic以及antagomir转染的影响。 5.通过骨肉瘤细胞化疗敏感性检测（CCK8）、细胞增殖、细胞凋亡和裸鼠成瘤实验验证mir-20a-5p在骨肉瘤细胞在化疗耐受中的作用机制。 结果： 1.RNA-Seq与miR-omic组学数据表明mir-20a-5p在G292细胞中的表达水平显著高于SJSA-1细胞中的表达水平，而SDC2的表达水平相反，提示SDC2可能是mir-20a-5p靶向基因之一。 2.qRT-PCR、western blot实验结果表明，mir-20a-5p在G292细胞中的表达水平显著高于SJSA-1细胞中的表达水平，而SDC2的表达水平相反，在敏感细胞株G-292细胞中的表达水平明显低于耐受细胞株SJSA-1中的表达水平。 3.双荧光素酶报告检测发现，mir-20a-5p可与SDC2的3’-UTR序列结合，降低了细胞内的荧光活性，证明了SDC2是mir-20a-5p的靶基因。 4.在SJSA-1细胞中转染mir-20a-5p的mimic，si-SDC2，发现SDC2的mRNA和蛋白表达均下调；在G-292细胞中转染mir-20a-5p的antagomir，发现GFP-SDC2SDC2的mRNA和蛋白均表达上调。 结果表明mir-20a-5p负向调控靶基因SDC2。 5.骨肉瘤化疗敏感性检测（CCK8）结果表明，mir-20a-5p的过表达能够抑制骨肉瘤细胞的对化疗药物的抗性，而mir-20a-5p的低表达能够促进骨肉瘤细胞对化疗药物的抗性。当敲除SDC2基因表达后，化疗耐受性SJSA-1细胞的CCK8检测结果与mir-20a-5p的过表达时结果一致，能提高骨肉瘤细胞的化疗敏感性；而过表达SDC2基因时，化疗敏感性G292细胞的CCK8检测结果与mir-20a-5p的低表达时结果一致，能增加骨肉瘤的化疗耐药性。此结果与细胞凋亡实验结果及裸鼠成瘤实验结果保持一致。 结论： 研究结果表明miR-20a-5p通过调控SDC2基因作用于骨肉瘤化疗药物耐药性。miR-20a-5p/SDC2调节通路可能是骨肉瘤患者的耐药标志物和治疗靶点。

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