雷氏大疣蛛毒蛋白分离纯化和生物活性测定

摘要

蜘蛛毒素是神经毒素的一个新的重要来源，蜘蛛毒液中有特异性生物活性的小分子是我们寻找无公害杀虫剂和新型药剂的最佳模式分子。本研究对异纺蛛科的雷氏大疣蛛Macrotheleraveni(Zhuetal.，2000)、施氏单柄蛛Haplopelmaschmidti(Wirth，1991)、狒蛛科的海南单柄蛛Haplopelmahainanum(Liangetal.，1999)、敬钊缨毛蛛Chilobrachyjingzhao(Zhuetal.，2001)四种蜘蛛毒素的抗虫、抗菌、抗肿瘤及对哺乳动物毒性等生物学性质进行了测定和比较，并从雷氏大疣蛛毒素中分离出单一抗虫组分MR-EⅢ。 本研究测定并比较了蜘蛛毒素对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)的胃毒活性和对大蜡螟(Gallermellonella)的血腔毒性，结果表明四种毒素对二者均有抑制生长和致死作用，其毒性具有良好的时效和量效作用关系，雷氏大疣蛛毒素对棉铃虫的胃毒活性最强，体重抑制率达到49.58％，死亡率达到55.45％，敬钊缨毛蛛毒素对大蜡螟(Gallermellonella)血腔注射后死亡率最高，达到87.28％，施氏单柄蛛毒素血腔注射后的体重抑制率最高，达到87.94％。通过两种不同作用方式的比较得知蜘蛛毒素血腔注射的效果好于胃毒效果，说明蜘蛛毒素以血腔毒性毒素为主，但也含有胃毒毒素的组分，不同种蜘蛛毒素之间的差异则是由其成分及成分含量的差异所决定的；通过平板纸碟法对蜘蛛毒素进行抑菌实验，结果表明雷氏大疣蛛和施氏单柄蛛毒素对革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有抑菌作用，而对真菌黄曲霉菌(Aspergillusflavussp)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、白色念珠菌(Moniliaalbican)，茄链格孢菌(Alternariasolani)没有作用，敬钊缨毛蛛和海南单柄蛛毒素对细菌和真菌都没有作用；肿瘤细胞四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定蜘蛛毒素体外作用人胃腺癌细胞BGC-823的药敏实验，发现四种毒素均具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，其中以雷氏大疣蛛毒素效果最强，IC50为15.9±0.01μg/mL，HE染色后观察到明显的细胞形态变化，细胞出现凋亡特征；通过腹腔注射毒素的方法将蜘蛛毒素作用哺乳动物昆明小鼠，发现雷氏大疣蛛毒素对昆明小鼠的毒性较强，LD50为2.83±0.03μg/g，将该毒对小鼠以较大剂量(10μg/g)腹腔注射后，小鼠表现出喘息、蜷伏、后肢麻痹、仅靠前腿爬行、抽搐等症状，2h后死亡。 对雷氏大疣蛛毒素成分进行分析，其中蛋白含量为78.8％。应用反相层析和阳离子伏、后肢麻痹、仅靠前腿爬行、抽搐等症状，2h后死亡。 对雷氏大疣蛛毒素成分进行分析，其中蛋白含量为78.8％。应用反相层析和阳离子交换的方法，从雷氏大疣蛛毒素中分离出一种对昆虫有毒而对哺乳动物毒性较小的抗虫蛋白，命名为MR-EⅢ。SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白分子量较小，小于14kD，在10kD左右。它对昆明小鼠毒性很小，对棉铃虫有较强的毒性，LD50为1.18±0.03μg/g。

目录

文摘

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引言

第1章文献综述

1.1蜘蛛的应用与研究

1.1.1蜘蛛的治虫特性

1.1.2蜘蛛丝的研究动向

1.1.3动物毒素研究

1.2蜘蛛毒素研究进展

1.2.1多肽神经毒素

1.2.2非神经毒素多肽

1.2.3酶

1.2.4生物胺

1.3蜘蛛毒素研究目的与应用

1.3.1新药研究与开发

1.3.2抗菌作用

1.3.3培育抗虫转基因植物

第2章蜘蛛毒素的生物学性质测定

2.1实验材料

2.2药品与试剂

2.3实验主要仪器

2.4实验方法

2.4.1蜘蛛毒素对昆虫的毒害作用

2.4.2雷氏大疣蛛毒素对哺乳动物昆明小鼠LD50的测定

2.4.3蜘蛛毒素对人胃腺癌细胞BGC-823的体外药敏实验

2.4.4蜘蛛毒素的抑菌作用

2.5结果与分析

2.5.1蜘蛛毒素对昆虫的毒害作用结果

2.5.2雷氏大疣蛛毒素对哺乳动物昆明小鼠LD50的测定结果

2.5.3蜘蛛毒素对人胃腺癌细胞BGC-823的体外药敏实验结果

2.5.4蜘蛛毒素的抗菌活性检测结果

第3章雷氏大疣蛛毒素蛋白抗虫蛋白的分离纯化

3.1实验材料

3.2实验仪器

3.3试剂和药品

3.4实验方法

3.4.1毒素蛋白含量测定

3.4.2样品处理

3.4.3雷氏大疣蛛毒素的分离纯化

3.4.4雷氏大疣蛛毒素分离组分的抗虫特性和毒性检测

3.5结果与分析

3.5.1雷氏大疣蛛毒素中蛋白含量的测定结果

3.5.2雷氏大疣蛛毒素反相层析分离结果

3.5.3雷氏大疣蛛毒素分离组分的抗虫特性和毒性检测

3.2.4阳离子交换分离结果

3.2.5 SDS-PAGE电泳结果

3.2.6雷氏大疣蛛抗虫蛋白MR-EⅢ对棉铃虫的LD50的测定

第4章讨论

4.1蜘蛛毒素的抗虫特性

4.2蜘蛛毒素的抗菌特性

4.3蜘蛛毒素的抗肿瘤活性

4.4雷氏大疣蛛毒素的分离纯化

第5章结论与创新点

参考文献

个人简历

致谢