一种食用担子菌抗真菌活性组分初步研究

摘要

随着深部真菌感染率的不断升高和现有抗真菌药物耐药性的日趋严重，临床上对广谱、高效、低毒的新型抗真菌药物的需求日益迫切。贵州大学真菌资源研究所分离获得的一种食用担子菌GZU-IFR5898，能产生明显抗真菌的活性物质。其抗菌谱涉及有引起人体脑膜炎、肺炎等的新型瘾球菌Cryptococcosi$、白色念珠菌Candidiasis和一些植物病原真菌，食品霉菌等具有较强的拮抗作用。　　从四川、重庆、昆明及贵州的花溪、乌当等地分离得到GZU-IFR5898的10余个菌株，从中得到一株抗真菌活性最强的菌株，定名为GZU-IFR5898-Km。GZU-IFR5898-KM菌株的发酵产物，用有机溶剂分级沉淀提取分离抗真菌活性成分(定名为5898-L)。Sevag法沉淀物后再进行薄层层析，将得到的单点用蛋白质定性方法—茚三酮反应，定性显示该物质为蛋白类，平行收集多个单点进行抗真菌活性检测证明，它们都具有抗真菌活性，证明被搜集的斑点为抗真菌的活性点。Sevag法除蛋白后，挥去试剂定容到原体积进行活性检测，活性没有明显变化，说明该物质不是单一的蛋白类。　　在最适反应条件下，胃蛋白酶和和胰蛋白酶对活性物5898-L的抗真菌活性无明显影响。Folin法测得蛋白含量为37.85％；Sevag法除蛋白后并用丙酮二次沉淀后，蒽酮法测得沉淀物的多糖含量为60％。说明粗提物主要含有蛋白和多糖的两种物质；TLC分离的单点5898-L活性物质部位可能是为糖蛋白或糖肽。　　下列处理可明显影响活性物质5898-L的产量。　　1.加入测试菌黑曲霉Asp.niger的孢子液，可明显刺激GZU-IFR5898-KM菌株产生活性代谢产物5898-L的形成，其产量可提高9.3％。2.起始pH在7左右的PDA液体培养基，每1OOml加入0.2gK2HPO4，经96小时发酵后，活性代谢产物5898-L的产量可提高8.1％。

目录

摘要

前言

1.1真菌疾病

1.2抗真菌抗生素

1.2.1.作用于真菌细胞膜

1.2.2作用于真菌细胞壁

1.2.3作用于蛋白质合成的抗真菌抗生素

1.2.4.其他的抗真菌药物

1.3抗真菌药物研制新技术

1.3.1真菌基因组学和蛋白质组学

1.3.2计算机辅助药物设计技术

1.3.3组合化学技术

1.4微生物产生抗真菌抗生素

1.5 5898-L的研究意义

第二部分材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株

2.2实验用培养基

2.3试剂及设备

2.4实验方法

2.4.1抗生素的检测

2.4.2菌浓(Packde cell volume=PVC)的测定方法

2.4.3活性物质粗分离

2.4.4活性物质的定性定量检测-Ⅰ-蛋白质

2.4.5活性物质的定性检测-Ⅱ-粗多糖

2.4.6粗活性物质的薄层分离纯化

2.4.7提高5898-L产量的培养条件研究

2.4.8 5898菌体辅酶Q10的分离提取研究

第三部分结果与分析

3.1黑曲霉孢子量对GZU-IFR5898抑菌圈形成的影响

3.2抗菌活性物质在GZU-IFR5898菌体内外的存在情况

3.3不同来源GZU-IFR5898分离株产抗菌物质的差异

3.4活性物质的初步分离及纯化

3.4.1乙酸乙脂萃取

3.4.2不同沉淀方法的对抗菌物获得的效果比较

3.4.3丙酮分级沉淀抗菌活性物中的粗蛋白测定

3.5丙酮分级沉淀后抗菌活性物的多糖含量测定

3.5.1葡萄糖溶液标准曲线的制

3.5.2待测粗提物除蛋白处理后对抗菌活性的影响

3.5.3抗菌活性沉淀物中粗多糖含量测定

3.6活性粗提物的薄层层析(TLC)分析

3.6.1展开剂

3.6.2单点定性

3.6.3单点全波扫描

3.7影响和提高58898-L产量的条件研究

3.7.1低温对抗菌物质及菌种稳定性的影响

3.7.2 pH值和温度对抗菌物质的影响

3.7.3培养过程中加入被抗菌对5898Km菌株产抗菌物的影响

3.7.4培养基初始pH呈碱性对5898Km菌株产抗菌物的影响

3.7.5培养基中不同Na2HPO4含量对5898Km菌株产抗菌物的影响

3.8 5898菌体中辅酶Q10

结语

致谢

参考文献

附图

发表论文及参加学术情况

原创性声明及关于学位论文使用授权的声明