某猪场爆发猪瘟的诊断及其病毒E2基因表达载体的构建

摘要

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种高度接触性传染病，以发热和出血为主要特征。世界动物卫生织(OIE)将其列为16种A类传染病之一，我国亦将之列为一类动物传染病。目前，CSF主要分布在亚洲、非洲、南美洲和欧洲的40多个国家和地区。调查显示，现阶段 CSF仍是对全球养猪业威胁最大的疾病，我国是猪瘟流行较严重的国家，我省各地也时常有猪瘟发生，每年因猪瘟死亡的猪占饲养总数的3％～5％，造成巨大的经济损失，因此对猪瘟的快速诊断和防制仍然具有十分重要的意义。
　　2007年6月贵州铜仁某猪场爆发了疑似猪瘟的疫情，通过流行病学调查、临床症状观察、病理剖检变化、金标卡检测、兔体交互试验及RT-PCR实验诊断后确诊为猪瘟。然后根据GenBank登录的猪瘟病毒 shimen，C株的E2基因序列设计一对特异引物，采摘病死猪的血液、扁桃体、淋巴结、脾、肾等组织提取总 RNA，并进行RT-PCR扩增，通过电泳检测和测序后获得预期目的DNA条带，并将其纯化后与pMD18-T载体连接、转化到 TOP10感受细胞中，在含 Amp的琼脂培养基中加入 IPTG和X-gal诱导培养，挑选白色菌落培养抽提质粒，用BamHI和HindⅢ酶切鉴定和测序后，将测序结果用DNAStar和DNAMAN软件与GenBank登录的猪瘟病毒shimen，C株进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较及遗传进化关系分析，并绘制遗传进化树。结果表明：该流行毒株与猪瘟病毒 shimen，C毒株的同源性为98.9％和94.9％氨基酸同源性为99.7％和98.1％,而与邻近省份流行毒株有一定差异，同时证明E2基因克隆成功。
　　在上述实验基础上，培养含pMD18-T-E2质粒的阳性菌落，提取pMD18-T-E2质粒，用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定纯化后，分别与双酶切的原核表达质粒 pET-32a(+)载体和真核表达载体 pcDNA3.1(+)，在T4连接酶作用下16℃连接过夜，然后分别转入感受态细胞 BL21和TOP10中，涂布平板，37℃过夜培养，通过抗性筛选、酶切鉴定和序列测定，表明原核表达质粒pET32a-E2和真核表达质粒pcDNA3.1-E2构建成功，该研究为进一步研究猪瘟病毒贵州流行株E2基因的体外表达、开发新型诊断试剂盒和新型疫苗的研究奠定了基础。

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第一章 某猪场爆发猪瘟的诊断

1 材料

2 发病经过及诊断

3.结果

4讨论

5 结论

第二章 猪瘟病毒 E2 基因的克隆及序列分析

1 材料

2 方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三章 猪瘟病毒 E2 基因表达载体的构建

1 试验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5.结论

第四章 猪瘟的诊断技术研究进展和猪瘟疫苗的研究进展

1 猪瘟病毒研究进展

2 猪瘟诊断技术研究进展

3 猪瘟疫苗的研究进展

参考文献

致谢

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