烟草中绿原酸含量的动态变化及RNA差异表达分析

摘要

绿原酸是烟草重要潜香型成分指标之一，为了探讨烟草绿原酸含量的动态变化、杂种优势，分析绿原酸合成途径关键酶基因的表达情况，本研究采用NCⅡ遗传交配设计，通过5种烟草类型13个品种（系）组配了40个杂交组合，在烟草生育期不同阶段对亲本以及杂种F1的烟叶绿原酸进行了测定，首先对绿原酸的测定方法进行了方法学考察，随后分析了亲本绿原酸含量性状的差异、杂交组合烟叶绿原酸含量的杂种优势表现与含量动态变化规律、以及绿原酸含量的相关性，最后采用实时荧光定量技术测定了绿原酸合成途径关键酶于移栽后74天、84天、91天、98天、105天的基因表达量，分析杂交组合（G70×湄潭大蛮烟、红花大金元×南江三号）表现为正向超亲优势的材料，分别以其双亲为对照的基因表达差异。相同母本材料杂交组合以其母本为对照的基因表达差异、绿原酸合成途径关键酶不同时期的基因表达差异以及绿原酸含量与关键酶基因表达积累量的相关性。主要研究结果如下：
　　1.本研究首先对绿原酸紫外分光光度法测定方法进行了方法学研究，实验仪器精度、稳定性样品、样品回收率高，具有良好的线性关系，线性公式为 Y=87.848X+0.4009（R2=0.9976）。说明该实验方法可行。
　　2.烤烟、白肋烟、香料烟、晾晒烟四种类型烟草绿原酸含量性状有极显著差异，其中烤烟类型绿原酸含量最高，达24.260 mg?g-1，白肋烟类型绿原酸含量最低，仅14.249 mg?g-1；烟草品种间绿原酸含量除了 TN90与永胜晒烟没有显著差异外，其余材料间均存在显著差异，其中烤烟类品种K326绿原酸含量最高，达28.544 mg?g-1，湄潭大蛮烟绿原酸含量最低，仅12.984 mg?g-1；烤烟类的7个品种间绿原酸含量存在极显著差异，其中红花大金元的绿原酸含量最低，仅21.333 mg?g-1，但极显著高于其他类型品种烟草。晾晒烟类型的4个品种间也均存在极显著差异。说明烟草绿原酸含量性状遗传资源丰富，有利于杂交组合的选择。
　　3.不同类型的亲本进行杂交后，其杂交组合绿原酸含量性状的杂种优势表现多样，烤烟与4种类型烟草进行杂交组配，可筛选出不同杂种优势表现的杂交组合。在40个参试材料中，表现为正向超亲优势的组合有12个，占30％，其中优势最强的杂交组合是G70×湄潭大蛮烟，优势率为42.49%，表现为负向超亲优势的组合为12个，占30%，其中优势最强的组合是NC82×南江三号，优势率为-15.862%，表现为中亲优势的杂交组合有26个，占40%。但是综合采收时绿原酸含量分析，表现正向超亲优势较强的杂交组合绿原酸含量都比较高，而表现为负向超亲优势的品种绿原酸含量不一定低，尤其是烤烟与烤烟的杂交组合。说明高含量绿原酸品种的筛选，可以参照正向超亲优势的表现。
　　4.由53个参试材料移栽后60、74、84、91、98、105、112天的绿原酸含量分析发现：原酸含量的动态变化类型分为五种：“M”型变化趋势，占24.53%、“N”型变化趋势，占37.73%、“W”型变化趋势，占16.98%、“V”型变化趋势，占13.20%、上升趋势，占7.55%。
　　5.由参试材料于7个时期烟叶绿原酸含量相关性分析得出，打顶前后（移栽后77天与移栽后84天）的烟叶绿原酸含量相关性不显著，并且打顶前与打顶后各时期的相关性越来越不显著，与含量动态变化结合分析发现打顶之后会使绿原酸含量有下降的趋势，随后开始增加，而呈完全上升趋势的材料对于打顶的表现是上升速率变慢。此外，绿原酸含量与叶长、叶宽、叶面积没有相关性。
　　6.表现为正向超亲优势的两个杂交组合（G70×湄潭大蛮烟、红花大金元×南江三号）5个关键酶基因的RT-PCR分析得出：在打顶前一周，PAL1、PAL2、4CL1、4CL2、HQT这5个关键酶基因以其双亲为对照的表达量近似，而在移栽后77天完成打顶之后，5个关键酶基因以其双亲为对照的表达量很低，而在打顶后第二周起，5个关键酶基因相对其亲本表达量回升，且PAL2在打顶后两周大量表达、4CL2、HQT在打顶后第三周大量表达。并且在杂种优势与基因表达量相关性分析中发现：基因4CL2在绿原酸含量的杂种优势中起到了关键性作用。
　　7.母本为红花大金元的两个杂交组合及其父本5个关键酶基因的PR-PCR分析得出：4个参试材料打顶前5个关键酶基因以母本红花大金元为对照的基因表达量都较高，在打顶之后的前两周5个关键酶的表达量极低，从打顶后第三周起，关键酶基因表达量开始升高。另外还发现白肋烟TN90在打顶之后基因表达量依旧高于其他3个参试材料，说明白肋烟绿原酸合成关键酶基因表达与烤烟类型品种不同，但烤烟和白肋烟杂交组合中的关键酶基因表达与烤烟品种相同。此外，父本与其杂交组合关于5个关键酶基因表达量都有显著正相关性。
　　8.由荧光定量PCR实验中3个杂交组合中关于绿原酸合成关键酶在不同时基因相对移栽后74天的基因表达分析得出：5个关键酶基因在不同时期表达量都有显著差异。此外，
　　将杂交组合的绿原酸含量与5个绿原酸合成关键酶基因的相对表达量的积累量进行相关性分析发现绿原酸含量与PAL1、PAL2、4CL1、4CL2、HQT以及关键酶基因总表达累积量都成正相关，并且与4CL1、4CL2、关键酶基因总表达累积量达到了极显著正相关。

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第一章 文献综述

1.1烟草绿原酸研究背景

1.2 mRNA差异显示技术

1.3 Real-time PCR技术

1.4 研究目的意义

第二章 材料与方法

2.1 材料及来源

2.2 田间试验方法与技术

2.3 技术路线

2.4 试验方法

第三章 结果与分析

3.1 绿原酸含量测定的方法学考察

3.2 烟叶绿原酸含量结果分析

3.3 绿原酸含量性状的动态变化

3.4 绿原酸含量性状的基因差异表达分析

第四章 结论与讨论

4.1 本研究的主要结论

4.2 烟草绿原酸提取与测定的优化设计

4.3烟草绿原酸含量性状的杂种优势表现和品种筛选

4.4 绿原酸含量的动态变化规律

4.5 绿原酸合成相关基因的选择与检测技术

4.6 参试材料实时荧光定量PCR的分析与讨论

4.6 本研究的创新性与局限性

致谢

参考文献

附录