贵州药用芫菁形态学和分子鉴定

摘要

芫菁是我国传统的中药材之一，因其体内含有斑蝥素而具有重要的药用价值，其可以治疗癌症等疾病，野生芫菁仍是药用斑蝥素的主要来源。本文总结了国内外芫菁科分类、分子、生物学特性、人工饲养、斑蝥素研究等概况，对展开了贵州药用芫菁形态学和分子鉴定研究，主要研究内容及结果如下：
　　分类记述
　　对贵州药用芫菁进行了系统的调查、整理和鉴定，共获得600多号标本，经鉴定有3属11种，其中有1新种：短突沟芫菁Hycleus breviprocessus sp. nov.和1贵州新纪录种：宽纹豆芫菁Epicauta waterhousei Haag-Rutenberg,1880；目前，贵州记载的药用芫菁上升到4属16种；对3属11种芫菁进行了详细的描述和绘制了雌雄性外生殖器特征图，并采集了数码图像和编制了贵州药用芫菁分类检索表，检视标本均保存于贵州大学昆虫研究所。
　　比较形态学研究
　　贵州现共有11种药用芫菁标本，从外部形态特征来看，可明显分为两大类，一类是斑芫菁族的种类（沟芫菁属的3种），一类是豆芫菁族的种类（包括豆芫菁属7种和齿爪芫菁属的1种）。前者的共有特征是：体黑色，触角似锤状且第3节长超过第4节的1.5倍，前胸背板具刻点且中线不完整，前足附节有毛垫，鞘翅具有斑纹和黑色短毛，阳茎具1背钩2腹钩；后者的共有特征是：体黑头红，触角基部有“瘤”突，前胸背板盘区具中纵沟且基部具1三角形凹洼，前足胫节有距，鞘翅被黑毛，阳茎具1背钩1腹钩。
　　斑芫菁族的种类其种间差异主要表现在：体型大小，鞘翅的斑纹形状、是否被黄毛，前胸背板浅凹的数量，阳茎基片形状，侧面观阳基侧突顶端侧叶长宽比和产卵瓣形状等。
　　豆芫菁族的种类其种间差异主要表现在：体型大小，触角的形状、是否被黑色长毛，触角基部的瘤突颜色，头部形状、长宽比，前足胫节和跗节是否被黑长毛，前足胫节端距的数目及形状，阳茎基形状及阳茎背钩和腹钩的形状和大小等。
　　为了补充和完善外部形态特征的比较，同时对部分种类芫菁的触角显微结构进行了比较研究。通过对贵州3属5种药用芫菁触角扫描电镜观察，获得触角形态图10张，感器图52张。首次对扁角豆芫菁E. impressicornis雌雄成虫异型触角进行电镜扫描，其雌雄成虫的触角差异很大，具有明显的性二型现象，触角存在大量的表皮孔（CP），并发现其触角感器类型共有5类10种；同时也对毛角豆芫菁E. hirticornis、灰边齿爪芫菁Denierella serrata、大斑沟芫菁指名亚种 H. phaleratus phaleratus、眼斑沟芫菁 H. cichorii的成虫触角进行电镜扫描的观察及比较，以上5种芫菁触角共有感器7种，即毛形感器（TS）、刺形感器（CS）、锥形感器（BS）、B?hm氏鬃毛（BB）、耳形感器（AS）（除扁角豆芫菁雌虫触角没有分布外）、芽形感器（GS）；豆芫菁属种类触角还分布有腔锥形感器（CoS）、栓锥形感器（StS）和指形感器（DS）；齿爪芫菁属种类触角没有分布腔锥形感器（CoS）、鳞形感器（CS）、指形感器（DS）和表皮孔（CP）；鳞形感器（CS）仅分布于沟芫菁属雄虫触角上。
　　分子鉴定研究
　　对10种贵州药用芫菁样本进行了DNA条形码基因片段筛选，选取4个DNA基因序列（即线粒体基因CO I和16S rDNA，核基因28S rDNA和ITS2）进行筛选，共获成功序列40条，并其进行了碱基组成成分、遗传距离和系统发育信号分析。
　　通过研究我们确定ITS2基因片段可作为贵州药用芫菁DNA条形码，10种贵州药用芫菁ITS2基因片段长度为477bp~543bp之间，其保守位点为48.2％,变异位点为58.4%。碱基组成A、T、C、G的平均含量分别为：29.7%、46.0%、7.8%、16.6%，具有非常高的A+T含量，为75.7%；ITS2基因片段属种间种内遗传距离分别为：0.6079±0.0460，0.5622±0.0706，0.1622±0.0206，说明属种间差异较大，种内差异小。同时初步构建了贵州药用芫菁的DNA条形码数据库，在NCBI数据库中，上传了豆芫菁属7种和齿爪芫菁属1种的ITS2序列，并获得相应的序列号为KU589257~KU589264。
　　同时对贵州药用芫菁10种进行ITS2基因序列进行了系统发育分析，数据应用PAUP4.10软件（MP和NJ法）和MEGA6.06软件（MP、NJ法和ML法）进行分析，获得了5棵ITS2基因序列分子系统发育树；由于建树方法和样本选取的不同，各个系统发育树之间存在一定的共性和不同；综合后选取ITS2序列（PAUP4.10软件）MP法构建的系统发育树作为较适合的合意树，其中贵州药用芫菁3个属均能和外群分开，外群在树的根部；沟芫菁属 Hycleus与齿爪芫菁属Denierella均能较好单独聚为一支，沟芫菁属 Hycleus在树的顶端，为进化类群；齿爪芫菁属Denierella在树的基部，为原始类群；但是豆芫菁属Epicauta不能全部单独聚为一支，其中一些种类与沟芫菁属 Hycleus聚为一支，另一些种与齿爪芫菁属Denierella聚为一支，然而这与我国豆芫菁属形态分类地位一直以来较为混乱一致，说明其分类地位有待进一步考究。

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前言

第一章 概 述

1 芫菁的分类地位及分布

2 触角的研究

3 芫菁生物学特性

4 芫菁的饲养

5 斑蝥素的功能及相关研究

6 分子方面研究

第二章 分类记述

1 材料和方法

2 分类特征及术语

3 结果与分析

4 小结与讨论

第三章 比较形态学研究

1 芫菁的形态比较研究

2 部分种类触角显微结构比较研究

第四章 分子鉴定研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 小结与讨论

第五章 结论与讨论

1 结论

2 讨论

3本文创新之处

4 本研究不足之处

5 今后的研究方向

致谢

参考文献

附录I

附录II

附录III

附录IV