肝内转移和多中心发生的多结节肝癌蛋白质表达谱的差异分析及差异蛋白的表达验证

摘要

肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是严重影响人类健康的恶性肿瘤之一，在肝癌的发展过程中可频繁发生肝内多个肿瘤结节，多结节肝癌的原因可能是由于原发灶的恶性肿瘤细胞的肝内播散形成的卫星肿瘤结节，即肝内转移(intrahepaticmetastasis，IM)，或者是序贯发生的多个独立肿瘤，即多中心发生(multicentricoccurrence，MO)。IM与MO反映了多结节肝癌两种重要的不同发病机制，可能对多结节肝癌的预后和治疗有不同的影响。为了区分这两种类型，需确定每个肿瘤结节的克隆能力，最准确的方法是通过确定每个肿瘤结节是单克隆还是多克隆来源来评价每个结节的本质。一个肝脏中的所有肿瘤结节的单克隆性表示所有的肿瘤结节是衍生于共同的原发灶；而多克隆性表示这些肿瘤结节是唯一且独立的。鉴别多结节肝癌的以上两种类型按惯例多从组织病理学着手，但这种方法比较主观。评价肿瘤克隆形成能力最准确特异的方法依赖于检测各个癌结节DNA变异类型，需确定每例的多个癌结节是单克隆或多克隆细胞来源。经典的方法是比较HBV在各个肿瘤中的整合类型，以此判断细胞来源。但该方法不仅限于HBV阳性肝癌患者，而且只适用于新鲜肿瘤标本，难以进行大样本量较深入的研究。p53基因是重要的抑癌基因，其突变或缺失在肿瘤的发生和发展中发挥了重要作用，p53基因在肿瘤细胞中最常见的突变点是第249位密码子，突变模式在不同的肝癌结节表现可能不同。近年来，多结节肝癌线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)非编码的置换区(D-loop区)的突变研究备受关注，D-loop区调控mtDNA的翻译和转录。肝癌组织中该D-loop区的频繁突变已被报道，其可用于鉴别每例多结节肝癌的细胞克隆来源。 目前，对于鉴别多结节HCC尚未有统一的金标准，蛋白质组学是整体分析蛋白表达最经典的方法，双向凝胶电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE)联合基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)技术是蛋白质组学领域最普遍、最重要的技术之一，目前对于多结节肝癌的蛋白质组学研究并不多，本课题拟利用2-DE联合质谱技术对IM、MO进行比较蛋白表达谱的研究，结果重点分析IM1与IM2、IM1与MO1、MO1与MO2、IM2与MO2之间的差异，发现细胞克隆来源不同的多中心发生HCC比相同细胞来源的肝内转移HCC的差异较大，希望从蛋白质组学方面为多结节肝癌的分子分型另辟蹊径，找到一些蛋白分子能提示IM和MO多结节肝癌的不同治疗和预后，为临床确定治疗方案及判断预后提供有效资料。 目的：比较分析多结节肝癌的肝内转移灶和多中心发生癌灶的蛋白表达谱，为更加准确的分子分型方法提供试验基础。 方法：对5例肝内转移和6例多中心发生的多结节肝癌按照结节大小分为IM1、IM2、MO1、MO2四组，联合双向凝胶电泳与质谱技术分析多结节肝癌的蛋白质表达差异。 结果：考马斯亮蓝染色获得了较为理想的电泳图谱：血清2-DE图谱共检测到平均蛋白质点数分别是各组平均蛋白点数分别为：1053±13(n=3)，1127±2(n=3)，1066±141(n=3)，1062±73(n=3)。匹配点数平均为：771±44，匹配率达72％。将IM1与IM2，MO1与MO2，IM1与MO1，IM2与MO2分别比较分析图谱，经质谱鉴定共得到30个差异点，去冗余后得到的蛋白共25种(proteinscored≥64)。利用GeneOntology(GO)数据库对鉴定所得蛋白进行功能分类，大多是与细胞运动、信号转导、氧化还原、脂类代谢、氨基酸代谢等有关的蛋白。 结论：多结节肝癌肝内转移和多中心发生的蛋白表达不同，2-DE联合质谱技术可作为二者分子分型的方法，有利于临床对肝癌患者实施治疗和判断预后。 目的：对肝内转移和多中心发生癌多结节肝癌的蛋白质差异进行表达验证。 方法：取4例多中心发生和4例肝内转移的肝癌组织标本，每例各取两个有大小差异的结节提取组织蛋白，选取L-FABP和HSP27两个差异蛋白进行Western-Blot免疫印迹实验验证质谱结果，选用GAPDH作为内参照。 结果：其中L-FABP在与M02比较中，IM2、MO1均下调，而HSP27在IM1下调，在MO1中上调。 结论：L-FABP和HSP27在IM1、IM2、MO1、MO2四组中表达趋势与质谱鉴定结果一致。 1.利用2-DE联合质谱技术平台，在IM1与IM2、IM1与MO1、MO1与MO2、IM2与MO2之间鉴定出25种差异蛋白。 2.通过较细致的比较多结节肝癌IM与MO不同大小结节间的蛋白质差异，发现一些蛋白分子，如HSP27、PrxII、L-FABP、Acyl等，也许能作为鉴别IM与MO的蛋白质标记物。 3.本研究利用比较蛋白质组学从复杂的肝癌组织标本中鉴别多结节肝癌IM与MO的差异蛋白质表达谱是可行的，可较理想的发现多因素影响下的肿瘤细胞蛋白质组的改变，为寻找直接参与肿瘤发生、发展、侵袭、转移的关键蛋白质分子和鉴别IM与MO拓宽了思路。 创新点 1.首次报道利用2-DE联合MALDI-TOF质谱技术作为鉴别IM与MO的方法。 2.应用蛋白质组学技术，国内首次研究多结节肝癌不同结节间的蛋白质差异，鉴定出25种差异蛋白，其中部分蛋白在多结节肝癌中差异表达为新报道。 潜在应用价值 1.2-DE联合质谱技术可作为鉴别肝内转移与多中心发生的多结节肝癌的一种分型方法，以弥补以往分子分型的一些缺陷。 2.通过2-DE联合质谱技术发现能区分多结节肝癌的肝内转移与多中心来源的蛋白标记物，能更方便的应用于临床进行治疗前的评估，决定治疗方案并对治疗后生存率进行预测，将很大地提高多结节肝癌的治疗水平。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语对照表

声明

前 言

第一部分肝内转移和多中心发生多结节肝癌蛋白质表达谱的差异分析

摘要

前 言

材料与方法

一、材料

二、方法

结 果

1.各组总蛋白2-DE图谱分析

2.四组差异蛋白质的质谱鉴定结果

讨 论

小结

参考文献

第二部分差异蛋白的表达验证

摘要

前言

材料及方法

一、材料

二、方法

结果

L-FABP、HSP27的Western blot免疫印迹验证

讨论

小结

参考文献

综述 多结节肝癌肝内转移与多中心发生的研究进展

攻读学位期间发表的学术论文

致 谢