AFB1诱发大鼠肝癌形成过程中差异表达基因筛选及Cullin7的功能研究

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一，是一种早期诊断困难、高度恶性、预后凶险的肿瘤。肝癌的形成是一个多因素、多步骤、多基因参与的过程，传统的单因素、单基因相关性分析难以全面准确反映肝癌复杂的病理机制，近年来随着功能基因组学及蛋白质组学的迅猛发展，不断地推动了肝癌发生机制、诊断和治疗等方面的研究进展。
　　 本研究用AFB1(AflatoxinB1，AFB1)诱发大鼠肝癌形成，以γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，γ-GT)染色阳性的肝细胞增生灶(γ-GT阳性灶)为标志获取肝癌前病变的组织标本，运用基因芯片技术对大鼠肝癌组织、肝癌前病变组织和正常肝组织的全基因组表达谱进行差异分析，筛选出一批差异基因。本研究对筛选出来的差异表达基因CUL7(cullin7)进行表达水平改变的验证，再应用RNA干扰(RNAinterfering，RNAi)技术对CUL7进行肿瘤相关生物学功能分析和机制探讨，以及应用实时定量PCR和免疫组化技术观察和分析CUL7在较大样本量的人肝癌组织中的表达及其临床意义。研究结果表明，CUL7在肝癌的发生发展过程中可能影响细胞的增殖、凋亡能力和细胞周期的调控，它编码的蛋白是E3泛素-蛋白连接酶复合物的组件，参与泛素依赖的蛋白质降解，CUL7在肝癌组织中高表达。这些结果提示CUL7可能是个潜在的肝癌诊断和预后评估的分子标志物。
　　 研究分以下四部分进行。
　　 第一部分AFB1诱发大鼠肝癌发生过程中差异表达基因研究
　　 目的：通过建立AFB1诱发大鼠肝癌实验模型，应用基因芯片技术观察大鼠肝癌发生发展不同阶段的肝组织中基因表达谱的改变，从中筛选出在肝癌发生过程中起重要作用的基因。
　　 方法：4周龄的雄性近交系Wistar大鼠随机分为实验组和对照组，实验组动物经腹腔注射AFB1诱发肝癌，对照组不予AFB1处理。分别于实验第14W、28W、42W、55W对全部动物进行肝活检，第64W处死全部动物。通过γ-GT组织化学染色并结合HE染色识别和获取肝癌前病变组织、肝癌组织和正常对照肝组织。三种组织标本各取3例，分别提取肝组织总RNA，然后按组织类别将3份总RNA等量混合，获得癌前、肝癌和正常三种组织RNA。经基因芯片技术筛选出癌前、肝癌和正常三种组织差异性表达基因。最后通过GeneOntology、KEGG和NCBI等数据库分析差异表达基因分子功能、生物过程、细胞组分以及生物学通路。
　　 结果：动物实验于64周结束，结果显示实验组共有19只动物发生肝癌，肝癌发生的最早时间为实验第51周；对照组无1例发生肝癌。γ-GT组织化学染色显示随着AFB1诱癌时间延长，γ-GT阳性灶数量增多、面积增大，癌前组织中γ-GT阳性灶总面积与肝组织切片面积比达35％～47％；肝癌组织γ-GT染色全为阳性；正常肝组织内无γ-GT阳性灶。应用基因芯片技术筛选出组间表达水平差异基因(以表达差异≥2.0或≤0.5倍为限)，其中肝癌组织与正常组织相比，有3753个上调表达基因，有3042个下调表达基因；肝癌组织与癌前组织相比，有4885个上调表达基因，有3477个下调表达基因，癌前组织与正常组织相比，有1027个上调表达基因，有1117个下调表达基因。在正常肝组织、癌前病变肝组织、肝癌组织表达依次上调的基因30个，在正常肝组织、癌前病变肝组织、肝癌组织表达依次下调的基因85个。经生物信息学分析，这些差异表达基因与细胞的增生、分化，细胞周期，细胞凋亡和细胞的信号传导密切相关。
　　 结论：通过γ-GT组织化学染色和HE染色相结合的方法有助于识别和获取大鼠肝癌前病变组织、肝癌组织及正常肝组织；大鼠肝癌发生发展不同阶段的基因表达谱存在明显差别；肝癌的发生发展可能与多种基因表达水平的改变有关。
　　 第二部分差异表达基因CUL7在大鼠和人肝癌组织中的表达验证
　　 目的：对筛选出来的感兴趣基因CUL7进行差异表达的验证。
　　 方法：应用RT-PCR和Westemblot方法检测CUL7在大鼠和人肝癌组织中的mRNA和蛋白质水平水平的表达情况。
　　 结果：①CUL7mRNA表达水平和蛋白表达水平在大鼠正常肝、肝癌前病变、肝癌组织中依次上调；②CUL7蛋白表达水平在人正常肝、癌旁肝及肝癌组织中也依次上调。
　　 结论：CUL7表达变化趋势与基因芯片筛选结果基本一致，在mRNA和蛋白质两个水平上，CUL7不仅在大鼠正常肝、肝癌前病变、肝癌组织中表达依次上调，并且在人正常肝、肝癌旁组织、肝癌组织中的表达水平也显著依次升高，提示CUL7可能参与人类肝癌的发生发展过程。
　　 第三部分肝癌差异表达基因CUL7的功能研究
　　 目的：为了进一步探讨CUL7在肝癌发生发展中的作用，本部分应用RNAi技术和肿瘤相关生物学功能鉴定方法，研究CUL7表达沉默对人肝癌细胞系SMMC-7721相关功能的影响。
　　 方法：将化学合成的CUL7小干扰RNA(siRNA)瞬时转染SMMC-7721细胞后，用Real-TimePCR和Westernblot检测证实SMMC-7721细胞中CUL7的mRNA和蛋白表达均明显受到抑制。设置CUL7siRNA转染组(RNAi组)、转染无效用dsRNA组(阴性对照组，Mock)和未转染组(空白对照组，Con)，观察三组细胞的凋亡、生长、粘附、运动和侵袭等肿瘤相关生物学功能的变化。
　　 结果：流式细胞仪分析结果显示，凋亡细胞比例在RNAi组、Mock组、Con组分别为67.45±5.83％、13.74±4.25％、16.69±3.18％。MTT实验结果显示，RNAi组的OD490值在24h、48h、72h分别为0.941±0.04，0.924±0.13，0.783±0.12。体外运动试验结果显示，穿过微孔滤膜到达下室面的细胞数在RNAi组、Mock组和Con组分别为26.35±1.55、68.33±3.55和65.77±3.18个，RNAi组与其余两组比较有显著差异(p＜0.05)。体外侵袭试验结果显示，穿过Matrigel和微孔滤膜到达下室面的细胞数在RNAi组、Mock组和Con组分别为14.38±2.37、45.38±4.16、48.67±2.51个，RNAi组与其余两组比较有显著差异(p＜0.05)。
　　 结论：CUL7可能通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，从而导致肝细胞的恶性转化。
　　 第四部分CUL7在较大样本人肝癌组织中的表达及临床意义的研究
　　 目的：分析人肝癌组织中CUL7的表达与患者的临床病理特征的关系。
　　 方法：利用Real-TimePCR和免疫组化技术检测CUL7mRNA和蛋白水平在62例人肝癌及其相应癌旁组织、12例正常人肝组织中的表达情况。
　　 结果：CUL7mRNA和CUL7蛋白表达水平在人肝癌中的表达明显高于癌旁及正常肝组织(均P＜0.05)，差异有统计学意义；而在正常组织的表达，与癌旁相比差别无统计学意义(P＞0.05)。CUL7在肝癌组织的表达水平与该组织的Edmondson病理分级、复发和远处转移相关，(p＜0.05)。
　　 结论：CUL7mRNA和CUL7蛋白表达水平在人肝癌中的表达明显高于癌旁及正常肝组织，差异有统计学意义；而在正常肝组织的表达，与癌旁相比差别无统计学意义，提示CUL7在肝癌的诊断和预后评估等方面具有潜在的临床应用价值。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要英文缩写

声明

前言

实验技术路线

第一部分 AFB1诱发大鼠肝癌发生过程中差异表达基因筛选

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分差异表达基因CUL7在大鼠和人肝癌组织中的表达验证

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分肝癌差异表基因CUL7的功能研究

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分CUL7在较大样本人肝癌中的表达及临床意义的研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文小结

综述：Cullin7的生物学功能和肿瘤的关系进展

致谢

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