hBMP-2基因修饰自体BMSCs移植促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究

摘要

目的：
　　牵张成骨(distraction osteogenesis，DO)是利用骨创伤后骨痂愈合机理产生新骨的一项内源性骨组织工程技术，已成为国内外口腔颌面外科研究的热点之一，并且随着近几年来的大量基础和临床研究，展现了该技术在颅颌面整形、肿瘤术后重建、牙槽种植等方面广阔的应用前景。尽管DO技术具有传统手术难以比拟的优势，但过长的牵张和固定时间，以及由此而产生的诸多并发症是限制其临床应用的主要原因。如何提高DO过程中新骨形成的速度和质量，缩短DO治疗时间，减少并发症的发生是目前该领域的研究热点。本研究的目的是拟通过RT-PCR技术从入骨肉瘤中提取并扩增hBMP-2基因片段，通过酶切技术将其插入pcDNA3.1构建成真核表达载体，利用基因转染方法将其导入兔骨髓间充质干细胞(MSCs)，并检测其在MSCs中的表达情况。然后将BMP-2基因修饰的自体MSCs植入兔下颌牵张成骨区，通过细胞可控地在需要的时段持续表达BMP-2，诱导MSCs自身或牵张成骨区的多潜能干细胞以及可能的成纤维细胞向成骨或成软骨细胞分化，模拟胚胎骨形成或骨折愈合的自然发生过程，使成骨级联再次启动，重续定向成骨分化，最终达到促进牵张成骨新骨形成与改建，从而大大缩短牵张成骨治疗周期，为进一步在临床上广泛使用牵张成骨技术治疗各种骨创伤或骨缺损奠定基础。
　　方法：
　　1、取2-3月龄健康新西兰白兔，穿刺抽取双侧股骨大转子部位骨髓约4-6 ml，采用贴壁分离法分离培养骨髓间充质干细胞，通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定;并向成骨细胞分化诱导培养，通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达，茜素红染色观察钙结节形成能力。
　　2、采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术，从入骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2基因片段，通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上，构建成pcDNA3.1-hBMP-2重组质粒。通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定。
　　3、采用比较成熟的脂质体介导的真核细胞转染技术，将含人BMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs，通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹法(westernblot)以及免疫组化等手段检测BMP-2-mRNA及其蛋白的表达。
　　4、取健康新西兰白兔36只随机分为3组，每组12只。实验组(注射BMP-2基因修饰的自体MSCs)、对照组（注射自体MSCs）、空白组（注射生理盐水）。术前3-4周分别根据编号对实验组及对照组动物自胫骨上端穿刺抽取骨髓，并做好对应编号进行传代培养，将兔自体MSCs培养传代至第P3代细胞后用hBMP-2基因转染修饰。建立牵张成骨动物模型，术后延迟期为5天，从术后第6天开始牵张，每天2次，每次0.5mm牵张，牵张长度7mm，随后固定。在固定期第2天，实验组于牵张间隙注射200μl的自体BMP-2基因修饰的自体MSCs液;对照组注射200μl的自体MSCs液;空白组注射200μl生理盐水。分别于牵张结束固定2w、6w分别摄X线片观察骨质愈合、改建情况;在固定术后2周、6周各实验组分别处死动物6只，通过大体病理、HE染色组织切片及扫面电镜观察各实验组新骨形成情况，并通过逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化等手段检测BMP-2-mRNA及其蛋白的表达情况。
　　结果：
　　1、兔骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞分化诱导:
　　MSCs刚分离接种时，其内血细胞混杂，成分不易分辨。3天后首次换液，可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形、多角形或短梭形外观，培养10-20天后细胞长满瓶底，可见成纤维样细胞克隆样增殖，成片生长。传代后观察:传代后细胞增殖速度明显加快，细胞排列整齐有序。使用条件培养基传代培养2周，细胞呈集落生长后开始形成钙结节，茜素红染色阳性，证明MSC已被诱导成为成骨细胞。
　　2、经PCR扩增、酶切电泳分析和DNA测序证实，本实验成功构建的重组质粒目的基因片段为人BMP-2-cDNA。
　　3、通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔骨髓间充质干细胞，并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实，转染pcDNA3.1-hBMP-2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP-2 mRNA的转录和蛋白的表达。
　　4、动物实验:于牵张结束固定2w、6w取标本，通过大体病理观察，从新生骨表面看，从质量或者硬度上由高到低排列为:实验组＞对照组=空白组;通过X线观察并经过灰度值统计软件分析，在固定期第2周及6周实验组牵张区骨密度明显高于对照组和空白组(p＜0.01)，在各期对照组和空白组牵张区骨密度比较未见明显差异(p＞0.05);固定2w、6w通过RT-PCR检测并通过电泳图像灰度值分析，实验组BMP-2mRNA相对光密度值显著高于对照组和空白组(P＜0.01)，而对照组和空白组BMP-2mRNA表达差别不大(P＞0.05);通过免疫组化显示:实验组固定2周、6周牵张间隙新生骨组织中均可见BMP-2强阳性表达，实验组平均灰度值低于对照组和空白组(P＜0.01)，而对照组和空白组间无差别(P＞0.05)。
　　结论：
　　1、全骨髓贴壁换液方法是一种简单实用的分离培养方法，可获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞;原代和传代保持了较高的增殖活力，经过诱导后可向成骨细胞分化，选取组织工程种子细胞以3代以前较为适宜。
　　2、成功构建了入骨形态发生蛋白-2基因真核表达质粒pcDNA3.1-hBMP-2，为后续实验奠定基础。
　　3、通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转入骨髓间充质干细胞，并使其获得较为稳定的表达。
　　4、用BMP-2基因修饰的自体MSCs移植能有效促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成，为临床上缩短牵张成骨治疗周期提供理论依据。

目录

声明

中英文对照表

摘要

前言

第一部分 兔骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞分化诱导的实验研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第二部分 hBMP-2真核表达载体的构建及鉴定

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第三部分 脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第四部分 hBMP-2基因修饰自体BMSCs移植促进兔下颌骨牵张成骨新骨形成的实验研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

四、结论

参考文献

全文总结

综述 基因治疗在牵张成骨中的应用前景

致谢