酶联免疫斑点法快速诊断活动性结核病的临床应用研究

摘要

[目的]
　　评估基于6KD早期分泌靶抗原(early secreting antigen target6KD，ESAT-6)和10KD培养滤液蛋白(culture filtrate protein10KD，CFP-10)抗原肽的酶联免疫斑点技术(Enzyme-Linked Immunospot Assay，ELISPOT)在高发病率国家诊断活动性结核病的真实性、可靠性和诊断价值。探讨ELISPOT快速诊断痰液结核分枝杆菌培养和痰涂片抗酸杆菌检查(Acid Fast Bacilli，AFB)阴性结核病、儿童结核病和肺外结核病的可行性。
　　[方法]
　　整群选取在2011年3月至8月期间到广西南宁市第四人民医院医院住院治疗的痰液细菌学培养阳性或组织病理学确诊的活动性结核病人140例作为结核病组，其中细菌学培养阳性90例，阴性36例。整群选取同期到该医院住院治疗的非结核病人98例作为对照组。收集研究对象的外周血单核细胞进行ELISPOT(T SPOT.TB; OxfordImmunotec Ltd.，Abingdon，UK)检测，同时进行结核菌素皮肤试验(Tuberculin skin test，TST)。结合最终临床诊断和微生物学的诊断，应用灵敏度、特异度、阳性预测值(Positive predictivevalue，PPV)、阴性预测值(Negative predictive value，NPV)、阳性似然比(Positive Likelihood Ratio)、阴性似然比(Negative Likelihood Ratio)、约登指数、诊断OR值和ELISPOT和TST的检测结果一致性等指标评价ELISPOT和TST在常规临床实践中诊断活动性结核病的真实性、诊断价值和可靠性。应用单因素和多因素非条件Logistic回归模型分析ELISPOT和TST灵敏度和特异度的影响因素。
　　[结果]
　　(1)ELISPOT斑点形成细胞(Spot forming cells，SFCs)分布:①结核组ESAT-6形成的SFCs数的中位数(74个/2.5×105PBMCs)显著高于对照组(11个/2.5×105PBMCs)(P＜0.001)，结核组CFP-10形成的SFCs数的中位数(100个/2.5×105PBMCs)也显著高于对照组(9个/2.5×105PBMCs)(P＜0.001)。②涂阳和涂阴结核组ESAT-6形成的SFCs数的中位数(92个和74个/2.5×105PBMCs)均高于对照组(11个/2.5×105PBMCs)，差异有统计学意义(P＜0.001)，涂阳和涂阴结核组CFP-10-ELISPOT形成的SFCs数的中位数(150个和100个/2.5×105PBMCs)均高于对照组(9个/2.5×105PBMCs)，差异有统计学意义(P＜0.001)。③结核病例ESAT-6和CFP-10抗原肽形成SFCs数与年龄、BMI指数和抗结核治疗时间等影响因素存在关联（P均＜0.05），与性别、BCG接种、既往结核病史、家庭接触结核病人和免疫抑制等其他影响因素均无关联（P均＞0.05）。
　　(2)TST硬结直径分布:①病例组和对照组TST硬结直径中位数分别为7.00mm(0～27.00mm)和4.50mm(0～15.00mm)，差异有统计学意义(P=0.007)。涂阳结核病组TST的硬结直径中位数是8.0mm(0～14.0mm)，涂阴结核病组硬结直径中位数是7.0mm(0～27.0mm)，对照组TST的硬结直径中位数是4.5mm(0～15.0mm)，三组病人TST硬结直径分布比较，差异有统计学意义（x2=7.912，P=0.023)。涂阳和涂阴结核病组TST硬结直径分布差异无统计学意义（P＞0.05），涂阳结核病组和涂阴结核病组硬结直径均大于对照组，分布差异有统计学意义（P值均＜0.05）。②在14例儿童结核病例和16例儿童对照者中，病例组TST的硬结直径中位数是10.8mm(0～21.0mm)，对照组TST的硬结直径中位数是3.5mm(2.0～15.0mm)，病例组的硬结直径显著大于对照组(P=0.008)。
　　(3)ELISPOT与TST总体诊断真实性与诊断价值:①ELISPOT诊断结核病的总体灵敏度为89.3％(95％CI:83.1-93.4)，特异度为82.7％(95％CI:74.0-88.9)，约登指数为0.72，PPV为88.0％(95％CI:81.7-92.4)，NPV为84.4％(95％CI:75.8-90.3)。②TST(≥5mm)诊断活动性结核病的总体灵敏度为68.3％(95％CI:59.6-75.9)，特异度为51.0％(95％CI:41.3-60.7)，约登指数为0.193，PPV为63.6％(95％CI:55.2-71.4)，NPV为56.2％(95％CI:45.8-66.0)。TST(≥10mm)诊断结核病的总体灵敏度为35.8％(95％CI:27.9-44.6)，特异度为91.8％(95％CI:84.7-95.8)，约登指数为0.276，PPV为84.6％(95％CI:72.5-91.2)，NPV为53.3％(95％CI:45.7-60.6)。痰涂片抗酸染色检查的灵敏度为22.1％（95％CI:15.9-29.7）。③ELISPOT的灵敏度、特异度、PPV和NPV均显著高于TST(≥5mm)(P值均＜0.001)，ELISPOT的灵敏度和NPV显著高于TST(≥10mm)(P＜0.001)，特异度低于TST(≥10mm)，PPV高于TST(≥10mm)，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。④ELISPOT、TST(≥5mm)和TST(≥10mm)阳性检测结果的活动性结核病诊断OR值分别为39.71(95％CI:18.78～83.93)、2.24(95％CI:1.30～3.88)和6.27(95％CI:2.78～14.11)。
　　(4)菌阳和菌阴结核病人ELISPOT和TST诊断灵敏度:①菌阳结核病人中，ELISPOT和TST诊断灵敏度分别为97.8％(45/46，95％CI:88.7～99.6)和90.0％(27/30，95％CI:74.4～96.5)，差异无统计学意义(P=0.33)。②菌阴结核病人中，ELISPOT和TST诊断灵敏度分别为86.7％(78/90，95％CI:78.1～92.2)和59.6％(53/89，95％CI:49.2～69.2)，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　(5)肺外结核病人ELISPOT和TST诊断灵敏度:28例肺外结核病例中，ELISPOT阳性灵敏度(85.7％)高于TST(70.8％)，差异无统计学意义(P=0.19)。4例结核性脑膜炎患者的ELISPOT结果都是阳性(100％)，但只有2例(50％) TST阳性。
　　(6)儿童结核病人ELISPOT和TST诊断真实性与诊断价值:①14个儿童活动性结核病例和16个儿童对照中，ELISPOT灵敏度为85.7％(95％CI:60.1～95.0)，特异度为93.8％(95％CI:71.7～98.9);②TST灵敏度为71.4％(95％CI:45.4～88.3)，特异度为56.3％(95％CI:33.2～76.9)。③ELISPOT的灵敏度高于TST，但无统计学意义（P＞0.05）;ELISPOT的特异度显著高于TST(P＜0.05)。
　　(7)ELISPOT和TST诊断结果一致性:①ELISPOT和TST总一致性较差（k=0.24）。在活动型结核病组中，ELISPOT和TST一致性较差(k=0.071)，类似地，在对照组中，ELISPOT和TST一致性也较差(k=0.15)。不一致的检测结果在结核病组中常见ELISPOT阳性而TST阴性（33例），而在对照组中常见于ELISPOT阴性而TST阳性（36例）。②在14个儿童活动型结核病例和16个儿童对照者中，ELISPOT和TST总一致性较差(k=0.35)。在结核病组中，ELISPOT和TST一致性较差（k=0.18），类似地，在对照组中，ELISPOT和TST一致性也较差(k=0.16)。不一致的检测结果在病例组中常见ELISPOT阳性而TST阴性（3例），而在对照组中常见于ELISPOT阴性而TST阳性(7例)。
　　(8)ELISPOT和TST灵敏度影响因素:①多因素分析显示，ELISPOT灵敏度未受研究对象性别、年龄、BMI指数、接种卡介苗、既往结核病史、家庭接触结核病人、免疫抑制等因素的影响（P值均＞0.05）。②多因素分析显示BMI指数＜18.5(OR=0.22，95％CI:0.08～0.59)、接种卡介苗(OR=4.36，95％CI:1.25～15.26)、家庭接触结核病人(OR=6.61，95％CI:1.69～25.93)、有免疫抑制(OR=0.076，95％CI:0.016～0.37)等4个因素（P值均＜0.05）是TST灵敏度的独立影响因素。提示营养不良、有免疫抑制更易使TST灵敏度降低，而接种卡介苗和家庭接触结核病人更易使TST灵敏度升高。
　　(9)ELISPOT和TST特异度影响因素:①多因素分析显示，ELISPOT假阳性率未受研究对象性别、年龄、BMI指数、接种卡介苗、免疫抑制等因素的影响（P值均＞0.05）。但既往结核病史(多因素分析OR=7.89，95％CI:1.15～54.02)、家庭接触结核病人（多因素分析OR=12.71，95％CI:2.56～63.22）是ELISPOT假阳性率的影响因素（P值均＜0.05）。提示家庭接触结核病人和既往结核病史更易使ELISPOT特异度降低。②多因素分析显示BMI指数＜18.5(OR=0.18，95％CI:0.04～0.82)、接种卡介苗(OR=12.73，95％CI:3.49～46.50)、既往结核病史(OR=83.85，95％CI:6.77～1038.38)、家庭接触结核病人(OR=21.69，95％CI:2.24～210.29)等4个因素（P值均＜0.05）是TST假阳性率的独立影响因素。提示营养不良更易使TST特异度升高，而接种卡介苗、既往结核病史和家庭接触结核病人更易使TST特异度降低。
　　[结论]
　　(1)基于ESAT-6和CFP-10抗原肽的ELISPOT技术在高发病率背景下诊断活动性结核病具有较高的诊断灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和诊断OR值，ELISPOT诊断活动性结核病的真实性、可靠性和诊断价值均高于TST。TST诊断灵敏度与特异度均较低，对活动性结核病的诊断的参考意义有限。
　　(2)ELISPOT的灵敏度不受研究参与者年龄、卡介苗接种、结核病接触史、既往结核病史和免疫抑制状况的显著影响，特异度也未受接种卡介苗的影响而降低，检测结果比TST更为可靠。
　　(3)ELISPOT也有明显的缺点，例如不能很好区分活动性结核病患者和潜伏性结核感染者，家庭接触结核病人和既往结核病史更易使ELISPOT特异度降低;由于人类白细胞抗原限制性，无法完全排除假阴性结果;T-SPOT-TB试剂盒价格较昂贵，难以在经济发展水平较低的地区推广应用，用于大规模普查结核病也是不现实的。对于TST硬结直径≥10mm、痰涂片抗酸杆菌检查阳性结核病人可不做ELISPOT检测。
　　(4)ELISPOT适合作为高发病率背景下临床实践中诊断活动性结核病，特别是涂阴结核病、肺外结核病和儿童结核病的可靠的辅助诊断手段，这有助于病例得到更快速的诊断和治疗，减少病人痛苦和不必要的医疗费用。

目录

声明

摘要

前言

参考文献

第一部分 研究设计

3．研究对象

4．研究方法

5．技术路线

参考文献

第二部分 ELISPOT与TST试验诊断的真实性与诊断价值

1．对象与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

第三部分 ELISPOT和TST试验灵敏度和特异度的影响因素

1．对象与方法

2．结果

3．讨论

4．小结

参考文献

全文总结

2．研究创新性

3．研究局限性

4．研究展望

文献综述 T-SPOT-TB检测技术诊断结核分枝杆菌感染的研究进展

附录

攻读学位期间发表的学术论文目录

攻读学位期间申请的课题

致谢