小鼠病毒性心肌炎Th17细胞的变化及意义

摘要

病毒性心肌炎(VMC)是常见的心血管疾病，其中以柯萨奇病毒B3(CVB3)感染最为常见，除可导致猝死外，部分患者还可以发展为扩张型心肌病(DCM)。VMC发病过程中心肌损伤的机制与病毒直接损伤、炎性因子对心肌的损伤和病毒感染后引起免疫介导的心肌损伤有关，包括自身免疫反应。尽管已有研究表明VMC的免疫损伤机制可能是由Th1/Th2细胞介导，但就这两个细胞亚群的研究并不能完全解释其发病机制。
　　Th17细胞是一种新发现的CD4+T辅助细胞亚群，以分泌IL-17为特征。研究表明，Th17细胞参与了人和动物多种自身免疫性疾病的发病过程。目前动物实验及临床研究均提示Th17细胞亚群及其效应分子IL-17可能参与了VMC的发病过程。但在VMC发病过程中Th17细胞的变化规律如何？相关细胞因子变化及其相互关系如何？哪种信号传导通路介导了VMC中Th17细胞的分化？目前无相关研究。为进一步了解Th17细胞在VMC发病过程中的变化，阐明Th17细胞在VMC中的作用、寻求VMC新的治疗靶点，本课题应用BALB/C小鼠腹腔注射CVB3建立VMC小鼠模型，进行以下四方面研究。
　　第一部分小鼠VMC不同时期Th17细胞及其相关因子变化规律
　　目的:观察小鼠VMC发病过程中Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α的动态演变，探讨Th17细胞及其细胞因子在VMC中的作用及意义。
　　方法:78只6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为VMC组(n=48)及对照组(n=30)。两组动物均设0、1、2、3、4、6周6个时点亚组，VMC组每个时点亚组8只。对照组每个时点亚组5只。采用腹腔接种CVB3建立VMC模型（VMC组），对照组（Control组）腹腔注射等量的PBS液，各组小鼠在规定时点取血，分离血浆，无菌取心脏和脾。HE染色了解心肌病理组织学改变并计算心肌病理积分、流式细胞术(FCS)检测小鼠脾Th17细胞数、RT-PCR检测心肌组织Th17相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α mRNA的表达，免疫组织化学检测小鼠心室肌组织IL-17蛋白表达水平，ELISA检测血清中IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α蛋白的表达。
　　结果:VMC组小鼠第1周开始心肌组织病理积分升高(1.8±0.5)，第2周达峰值(2.8±0.4)，第3周降低，与对照组相应时点亚组比较差异有显著性(P＜0.05)。对照组各时点亚组无明显差异(P＞0.05)。CVB3感染1周时，Th17细胞即开始升高(2.23±0.89％)，峰值在4周时出现(5.00±0.81％)，并维持升高趋势至6周(2.35±0.35％)，除0周时点外，VMC组Th17细胞比例均高于对照组相应时点(P＜0.01)。对照组各时点亚组无明显差异(P＞0.05)。VMC小鼠1周时心肌组织IL-17mRNA开始升高，4周时IL-17 mRNA达峰值，并一直持续至6周。除0周时点外，VMC组其他时点IL-17 mRNA与看家基因β-actin灰度值(OD)比均高于对照组(P＜0.01)。对照组各时点亚组无明显差异(P＞0.05)。免疫组化结果显示，VMC小鼠心室肌组织中IL-17蛋白在感染1周时开始表达，4周时达峰值，6周时仍高于对照组。除0周时点外，VMC组其他时点IL-17蛋白表达量均高于对照组（P＜0.01）。对照组各时点亚组无明显差异(P＞0.05)。VMC组小鼠血清中IL-17浓度在第1周升高，4周时达峰值，6周呈现下降趋势。除0周时点外，VMC组其他时点IL-17蛋白表达量均高于对照组(P＜0.01)。对照组各时点亚组无明显差异（P＞0.05）。IL-23mRNA及蛋白表达规律与IL-17相似，即表现为:在第1周时升高，4周时达峰值，6周呈现下降趋势。小鼠心肌组织中IL-6和TNF-α的mRNA及血清中相应蛋白均在第1周时升高，至2周时达峰值，并维持至6周。除0周时点外，VMC组其他时点IL-6、TNF-α灰度比均高于对照组(P＜0.05)。
　　结论:VMC小鼠1-6周Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α呈现高表达，提示Th17细胞及其相关因子可能参与了VMC的发病。
　　第二部分:抗IL-17单克隆抗体对小鼠VMC的干预作用
　　目的:观察体内拮抗IL-17后对小鼠VMC的干预作用，从而进一步确定Th17细胞及其效应因子IL-17在VMC中的作用。
　　方法:6周龄雄性BABL/c小鼠32只，随机分成4组，IL-17单克隆抗体组（IL-17mAb组）、同型对照组（Isotype组）、PBS组和正常BABL/c小鼠组（normal组）。IL-17mAb(n=8)、Isotype(n=8)和PBS组(n=8)小鼠均腹腔注射含100TCID50CVB3病毒0.1ml/只，在接种病毒后第4、7、10天，IL-17mAb、Isotype和PBS组小鼠分别腹腔注射100μg/0.1mlIL-17mAb、Isotype和PBS，正常组(n=8)不注射病毒，也不予任何干预。第14天时用Kaplan-Meier生存曲线评估各组小鼠生存率的变化、HE染色了解心肌病理改变、RT-PCR检测小鼠心肌组织IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α mRNA的表达、免疫组织化学检测小鼠心室肌组织IL-17的表达水平，ELISA检测血清中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α的蛋白表达、FCS检测各组小鼠脾Th17细胞数变化。
　　结果:IL-17mAb可改善VMC小鼠生存率、降低心脏重量/体重(HW/BW)比值、减少心肌组织内炎性浸润灶、降低心肌病理积分。同时减少心肌中IL-17蛋白的表达、降低血清中IL-17的水平，但不影响心肌组织IL-17mRNA及IL-6、IL-23、TNF-α mRNA及血清中蛋白的表达，也不影响脾Th17亚群细胞的增殖。
　　结论:在小鼠VMC4天时给予IL-17抗体干预，可减轻心肌炎症、改善小鼠的生存率，进一步验证Th17/IL-17参与了VMC的发生发展。
　　第三部分:细胞因子对VMC小鼠脾Th17细胞的影响
　　目的:观察不同细胞因子对VMC小鼠脾中已分化的Th17细胞增殖作用的影响。
　　方法:6周龄雄性BALB/c腹腔接种CVB3建立VMC小鼠模型，1周后无菌取脾，磁珠分离CD4+T细胞，分别用rIL-23(10ng/ml)、TGF-β(10ng/ml)、TGF-β(10ng/ml)+IL-6(20ng/ml)和TGF-β(10ng/ml)+IL-6(20ng/ml)+rIL-23(10ng/ml)进行体外刺激培养，FCS检测培养后Th17细胞数、RT-PCR检测培养细胞IL-17mRNA的表达、 ELISA检测培养上清液中IL-17的变化。
　　结果:与TGF-β单独或联合IL-6刺激比较，rIL-23刺激能显著增加Th17细胞数，培养细胞中IL-17 mRNA表达及培养上清液中IL-17浓度增加(P＜0.05)。而TGF-B(10ng/ml)单独或联合IL-6(20ng/ml)刺激均不能增加培养细胞的Th17细胞数(P＞0.05)，培养细胞中IL-17mRNA表达及培养上清液中IL-17浓度也无明显增加(P＞0.05)。
　　结论:rIL-23能促进已分化的Th17细胞增殖，而TGF-β和/或IL-6单独或联合刺激不能促进已分化的Th17细胞增殖。
　　第四部分:STAT3信号通路在小鼠VMC Th17细胞分化中的作用
　　目的:观察小鼠VMC中STAT3信号通路的表达及对Th17细胞分化的影响。
　　方法:在小鼠VMC不同时期STAT3信号通路的表达研究中（小鼠分组取材同第一部分研究一），RT-PCR检测小鼠心肌组织STAT3 mRNA的表达，Western Blot技术检测VMC小鼠心肌组织中p-STAT3的相对含量。VMC1周小鼠无菌取脾，磁珠分离CD4+T细胞后进行体外细胞培养，培养液中分别加入或不加STAT3抑制剂（S3I-201，100uM）。培养48小时后收集细胞，FCS检测培养后Th17细胞数变化，应用RT-PCR检测培养细胞中IL-17、STAT3 mRNA的表达，ELISA检测培养上清液中IL-17的变化。
　　结果:与对照组比较，VMC小鼠在接种病毒后第1周，心室肌组织STAT3mRNA表达升高，4周时达峰值，至6周时仍高于对照组(P＜0.05)。对照组各时点亚组无明显差异(P＞0.05)。Western Blot结果显示，VMC小鼠在接种病毒后第1周，心室肌组织p-STAT3表达增加，4周时达峰值，至6周时仍高于对照组(P＜0.05)。对照组各时点亚组比较无统计学差异(P＞0.05)。S3I-201能抑制Th17细胞的增殖(5.02±1.06％比3.85±0.94％，P＜0.05)，培养细胞IL-17 mRNA表达下降、培养上清液中IL-17浓度降低(P＜0.05)。
　　结论:小鼠VMC发病过程中存在STAT3通路的激活，应用STAT3特异性抑制剂S3I-201能抑制Th17细胞的增殖。
　　本课题研究结果显示:(1) VMC小鼠1-6周，Th17细胞比例升高，伴有其相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α mRNA及蛋白表达上调，其中Th17细胞比例和IL-17、IL-23 mRNA及蛋白表达高峰在4周出现，IL-6、TNF-α mRNA及蛋白表达高峰在2周出现，均维持较高水平至6周，提示Th17细胞及其相关细胞因子可能参与VMC发病过程;(2)IL-17单克隆抗体可部分改善VMC小鼠心肌病理变化，增加生存率;(3)rIL-23是VMC小鼠脾中已分化的Th17细胞增殖的必须细胞因子，TGF-β单独或联合IL-6刺激对已分化的Th17细胞无增殖作用。(4) STAT3信号转导通路介导了VMC小鼠Th17细胞亚群的分化与增殖。

目录

声明

摘要

前言

第一部分 小鼠病毒性心肌炎不同时期Th17细胞及其相关因子变化规律的研究

第二部分 抗IL-17单克隆抗体对小鼠病毒性心肌炎的干预作用

第三部分 细胞因子对病毒性心肌炎小鼠脾Th17细胞的作用

第四部分 STAT3信号通路在小鼠VMCTh17细胞分化中的作用

全文总结

本课题的创新点

参考文献

附录

综述 白细胞介素17与心血管疾病

综述二 IL-23／Th17轴与自身免疫性疾病

致谢

个人简历

读博士期间撰写的论文