microRNA-24对内皮型一氧化氮合酶表达调节及血管内皮细胞增殖的影响及相关机制研究

摘要

目的:
　　为进一步探讨miRNA-24是否参与eNOS表达的调控及其对血管内皮细胞增殖的影响，本研究构建miRNA-24高表达质粒，并用脂质体将其导入人类脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)，观察miRNA-24对eNOS表达及HUVECs增殖的影响并探讨其相关分子机制。
　　方法:
　　1.miRNA-24对HUVECs增殖影响。
　　用脂质体LipofectamineTM2000将miRNA-24高表达质粒、空白质粒、anti-miRNA-24高表达质粒分别转染入1640培养基孵育的HUVECs中，4h后更换含10％胎牛血清的1640培养基继续培养。在12h，24h，48 h，72 h四个时间点用细胞计数法计数细胞增殖数量;MTT检测细胞增殖情况;细胞划痕法检测细胞迁移情况;Griess法检测培养上清的NO含量。
　　2.miRNA-24对eNOS表达的影响
　　用脂质体LipofectamineTM2000将miRNA-24高表达质粒、空白质粒、anti-miRNA-24高表达质粒分别转染入1640培养基孵育的HUVECs中，4h后更换含10％胎牛血清的1640培养基继续培养24h。实时荧光定量PCR检测eNOS的mRNA表达情况;免疫组织化学法和Western blot法检测eNOS蛋白质表达水平。
　　3.miRNA-24对SP-1表达的影响
　　用脂质体LipofectamineTM2000将miRNA-24高表达质粒、空白质粒、anti-miRNA-24高表达质粒分别转染入1640培养基孵育的HUVECs中，4h后更换含10％胎牛血清的1640培养基继续培养24h。荧光定量PCR检测SP-1的mRNA表达情况;免疫组织化学法检测SP-1蛋白质表达情况;Western blot法检测SP-1蛋白质表达水平。
　　4.证实eNOS和SP-1是miRNA-24的靶基因
　　生物信息学结果显示，miR-24通过与eNOS和Sp-1的3'-UTR结合参与其表达的调控，我们分别构建了包含eNOS-3'UTR和SP-1-3'UTR区野生型、突变型序列的荧光素酶报告系统（pMIR-Report）并分别命名为pGL3-eNOS-wt,pGL3-eNOS-mut,pGL3-Sp1-wt, pGL3-Sp1-mut，将HUVECs种于24孔板中，用脂质体作为载体将报告质粒和荧光素酶报告系统（海肾荧光素酶和miR-24或空白质粒）一同转染4小时。荧光酶素的活性由双荧光素酶报告分析系统检测。
　　结果:
　　1.与对照组比较，miRNA-24高表达组细胞数目减少(P＜0.01)，增殖和迁移速度减慢(P＜0.05)，NO释放也明显减少(P＜0.01)。
　　2.与对照组比较，miRNA-24高表达组eNOS的mRNA和蛋白表达明显减少(P＜0.05)。
　　3.与对照组比较，miRNA-24高表达组SP-1的mRNA和蛋白表达明显减少(P＜0.05)。
　　4.与突变型报告质粒相比较，野生型荧光酶素报告质粒pGL3-eNOS-wt和pGL3-Sp-1-wt共转染时miRNA-24可以显著降低其活性(P＜0.01)。
　　结论:
　　1.高表达miRNA-24可以抑制人类脐静脉内皮细胞的增殖，减少细胞数量，减少人类脐静脉内皮细胞NO的合成。
　　2.miRNA-24抑制HUVECs中eNOS的mRNA和蛋白质表达，eNOS是HUVECs中miRNA-24的靶基因。
　　3.miRNA-24抑制HUVECs中SP-1的mRNA和蛋白质表达，SP-1是HUVECs中miRNA-24的靶基因。
　　4.miRNA-24可在转录后水平通过影响细胞因子SP-1间接调控eNOS在HUVECs的表达。

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主要中英文缩略写

摘要

前言

参考文献

第一部分 miR-24对HUVECs增殖的影响

实验材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 miR-24对内皮型一氧化氮合酶表达的影响及相关分子机制

实验材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

综述

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

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