裂果薯总皂苷抗肝癌作用与裂果薯皂苷SSPH通过ROS-Erk通路抑制Hela细胞的作用机制研究

摘要

目的：1.裂果薯总皂苷(SFSP)抗肝癌作用初探；2.裂果薯皂苷单体1(SSPH)对肿瘤细胞作用机制研究。
　　方法：SFSP对人肝癌细胞SMMC-7721与Bel-7404的细胞增殖与集落形成的抑制作用通过MTT实验测定。使用免疫荧光法观察SFSP对SMMC-7721细胞形态影响与VEGF表达的影响。使用MTT法测定SFSP对其他抗肿瘤药物作用的影响。以家兔红细胞溶血实验与小鼠急性毒性试验验证SFSP的安全性，并测定SFSP对人原代肝细胞HL-7702的抑制作用。使用Hochest33258染色观察裂果薯对细胞核染色体形态的改变。SMMC-7721与Bel-7404的凋亡与细胞周期阻滞情况以流式细胞仪通过PE/7-AAD染色法检测，SMMC-7721与Bel-7404细胞中活性氧的水平也以流式细胞仪检测，Caspase-3，-8与-9的激活情况使用ELISA法测定。我们使用Western blot检测SFSP对MAPK信号通路的表达与磷酸化情况，并以相关通路阻断剂与激活剂验证其效果。SFSP的体内抗肿瘤作用以人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤模型验证，免疫组化法观察移植瘤内相关蛋白的表达情况并与体外实验相互印证。SSPH对Hela细胞的抑制作用由Neutral Red法与WST-8法检测。荧光素酶法初步检测SSPH对Hela细胞肿瘤相关通路的影响。qRT-PCR法测定SSPH对Hela细胞肿瘤通路相关基因表达的影响，并以各通路抑制剂验证SSPH可能的作用通路。SSPH对Hela细胞的凋亡诱导作用由流式细胞仪使用Annexin V/PI染色法检测，凋亡相关蛋白的表达由WB检测。SSPH对MAPK信号通路的激活作用以细胞内WB法测定。SSPH对ROS的影响由流式细胞仪检测并与NAC联用验证。SSPH对MAPK信号通路的表达与磷酸化的影响由WB测定并与NAC联用验证。
　　结果：SFSP显著抑制SMMC-7721与Bel-7404的增殖，其24h的IC50为3.75与3.93μg/ml，SFSP对这两种细胞的集落形成能力也有显著抑制作用，其最高抑制率为83.37与89.02％。免疫荧光观察显示SFSP使SMMC-7721细胞微管蛋白形态异常且VEGF的表达降低。SFSP对阿霉素与柔红霉素的体外抗肿瘤作用没有明显影响，但显著降低紫杉醇对SMMC-7721细胞的抑制作用。SFSP对HL-7702细胞的IC50为47.6μg/ml，显著高于SFSP对两种肝癌细胞的IC50值。SFSP对家兔红细胞的溶血浓度为60.2μg/ml，对小鼠急性毒性实验显示SFSP在5000mg/kg/day无毒性反应，显著低于裂果薯醇提物4520mg/kg/D的LD50剂量，证明SFSP是一种安全性良好的药物。Hochest33258染色观察提示SFSP可能对SMMC-7721有凋亡诱导作用。PE/7-AAD染色观察验证了这一观察结果，SFSP在2、5和10μg/ml剂量下造成40.23%，42,30%和46.83%的SMMC-7721细胞凋亡，在同样剂量下造成14.50%，33.97%与46.77%的Bel-7404细胞凋亡。SFSP也使这两种细胞阻滞于G2/M期中，SFSP10μg/ml将31.3%的SMMC-7721细胞或32.5%的Bel-7404细胞阻滞于G2/M期，而空白组处于G2/M期的细胞仅为18.8%与16.6%。Caspase活性检测发现SFSP能激活SMMC-7721与Bel-7404细胞中Caspase-3，-8与-9，同时SFSP还能提升SMMC-7721细胞内ROS的含量。WB结果显示，SFSP能够在不影响JNK，Erk与p38的表达的情况下提升JNK与Erk的磷酸化水平，并且降低p38的磷酸化水平。JNK，Erk特殊抑制剂能够阻断SFSP对JNK与Erk信号通路的激活作用，p38特殊激动剂能够阻断SFSP对p38的抑制作用，但仅有Erk与JNK的阻断影响SFSP的细胞毒性作用。SFSP能够显著的抑制裸鼠肿瘤的重量与体积。高剂量组（50mg/kg/day）（p<0.01），中剂量组（25mg/kg/day）（p<0.05）与阳性药物组（15mg/kg/day）（p<0.01）均对裸鼠的肿瘤体积与重量有显著抑制作用，其中高剂量组的抑制率为65.20%，免疫组化法验证SFSP在瘤组织内也可激动Erk与JNK信号通路并抑制p38信号通路，提示SFSP在体内与体外对MAPK信号通路有相似的调控作用。Neutral Red实验与WST-8实验证明SSPH对Hela细胞的增殖有着显著的抑制作用，其IC50为4.13μM。SSPH对Stat3，Smad，NF-κB，E2F，Myc，Ets与Wnt P具有显著抑制作用。qRT-PCR结果显示SSPH可在一定时间点将A20，AXIN2，BCL2，CCND1，PYGO2和TERT基因激活至2.53,2.50,2.15,2.14,2.05与3.00倍。进一步与各通路抑制剂联用的结果显示SSPH可能对MEK信号通路，NF-κB信号通路以及PI3K信号通路具有调控作用。细胞内WB的结果证实SSPH对MEK具有激活作用，p-Erk在经历15min时的短暂下降之后，磷酸化程度持续增强，而p-JNK与p-p38的表达并未出现明显变化。SSPH作用24h后显著诱导Hela细胞凋亡，并存在剂量依赖性。SSPH12μM作用下，Hela细胞出现凋亡（p<0.01），其早期凋亡率为10.62%，晚期凋亡与坏死率为38.14%。6μM SSPH在作用24 h后显著提升细胞内ROS的含量，Hela细胞内ROS增加30%。NAC可以阻断SSPH造成的ROS提升，10mM NAC预处理Hela细胞1h后与6μM SSPH共同作用，ROS增加量减少20%。SSPH持续提升Hela细胞内Erk1/2的磷酸化水平，但是当SSPH与NAC协同作用时，Erk1/2磷酸化水平显著低于SSPH单独作用组。SSPH与NAC对JNK与p38信号通路没有作用，WB结果显示各个时间点JNK与p38的表达量与磷酸化程度均无改变。WST-8测定SSPH联合NAC与UO126的细胞毒性结果显示，NAC与UO126均降低SSPH的细胞毒性作用。SSPH增加c-PARP，减少Caspase3与PARP，且可被NAC阻断，证明SSPH可通过增加ROS诱导Hela细胞凋亡。
　　结论：SFSP在体内与体外对肝癌细胞具有增殖抑制作用，SFSP通过调控MAPK信号通路抑制肝癌细胞的增殖，并且在体内对MAPK信号通路也有类似的调控作用。而SSPH通过诱导细胞内ROS的升高激活Erk1/2信号通路，进而诱导Hela细胞的凋亡与增殖抑制。实验结果证明SFSP与SSPH均为潜在的抗肿瘤药物。

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前言

第一部分 裂果薯总皂苷(SFSP)体外抗人肝癌作用初探及对MAPK信号通路的作用研究

前言

1.材料与方法

2.实验结果

讨论

参考文献

第二部分 裂果薯总皂苷(SFSP)对人肝癌细胞SMMC-7721裸鼠移植瘤模型移植瘤抑制作用

前言

1.材料与方法

2.实验结果

讨论

参考文献

第三部分SSPH对Hela细胞抑制作用与机制

前言

1.材料与方法

2.实验结果

讨论

结论

参考文献

综述:甾体皂苷类抗肿瘤研究进展

致谢