火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠空间学习和记忆的干预作用及其机制研究

摘要

自上世纪90年代以来，人口出生率的下降和人均预期寿命的延长使中国人口老龄化的现象日益突出。随着年龄的增长，正常老年人客观上都发生脑老化，并伴随有不同程度的记忆力减退。此外，阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)等神经退行性疾病引发的认知功能障碍也成为困扰老年人的一大难题。因此，研究认知衰老的相关机制，探寻延缓脑老化、改善学习和记忆障碍的有效干预措施，对实现健康老龄化和提高老年人生活质量至关重要。
　　火麻仁提取液(Extraciton of Fructus Cannabis，EFC)的来源是火麻仁的干燥成熟果实，其主要成分是饱和脂肪酸及多不饱和脂肪酸。近年来研究发现火麻仁对中枢神经系统、心血管系统、消化系统和免疫系统等具有广泛的药理作用，在抗氧化、抗炎、抗血栓和降低血脂等方面也有良好的疗效。但火麻仁是否对与老龄相关的认知损害有预防保护作用尚不清楚。
　　目的:
　　用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)建立亚急性衰老大鼠模型，观察EFC对D-gal致衰老大鼠在Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)空间学习和记忆能力的影响，并在mRNA和蛋白水平检测与脑老化相关的基因及蛋白表达情况，探讨衰老过程中认知减退的分子生物学机制;同时进一步在细胞水平，通过D-gal诱导小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)的老化，观察EFC干预对细胞衰老进程的影响。综上所述，本研究旨在探讨EFC对D-gal致衰老大鼠的空间学习及记忆障碍的保护作用及其机制。
　　方法:
　　1.将雄性SD大鼠按随机数字表法分为6组，每组8只，分组方法如下:正常对照组(control)、D-gal模型组（400mg/kg）、EFC(200mg/kg)预防组、EFC(400mg/kg)预防组、D-gal+EFC(200mg/kg)组及D-gal+EFC（400mg/kg）组。以D-gal(400mg/kg)连续腹腔注射14周的方法建立亚急性衰老模型。D-gal模型组大鼠每日给予腹腔注射D-gal400mg/kg，每日一次，连续给药14周;正常对照组给予腹腔注射等量生理盐水。EFC预防组于D-gal造模前分别预防性给予200mg/kg、400 mg/kg EFC连续灌胃14周，随后给予D-gal腹腔注射14周。D-gal+EFC组为D-gal造模同时分别给予EFC200mg/kg、400mg/kg灌胃，连续14周。此外，正常对照组与D-gal模型组给予等量生理盐水的灌胃。
　　2.利用Morris水迷宫评估D-gal致衰老大鼠的空间学习及记忆能力。
　　3.采用HE染色法观察D-gal致衰老大鼠海马锥体神经元的病理结构变化。
　　4.WST-1法测定大鼠脑组织中的总超氧化物歧化酶(super oxidedismutase，SOD)活力及TBA法测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平。
　　5.称重并计算心脏、肝脏、脾脏和胸腺的脏器系数。
　　6.应用免疫荧光法检测大鼠海马齿状回γ-H2AX及星形胶质细胞活化标志物GFAP的表达。
　　7.应用定量逆转录聚合酶连锁反应(quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction，qRT-PCR)技术检测并比较各组大鼠海马组织中的APP、Tau、PS1基因的mRNA的表达差异。
　　8.免疫印迹法检测大鼠海马组织中与脑老化相关的total Tau，p-Tau、PS1蛋白的表达水平。
　　9.以D-gal诱导NIH/3T3细胞的老化，EFC作为干预因素，从以下几方面探讨EFC对D-gal致衰老细胞的作用:
　　9.1加载DHE荧光探针初步评估细胞内总ROS生成量后，应用FACS流式细胞仪定量分析细胞内总ROS水平。
　　9.2检测各处理组细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶(Senescence-associated-β-galactose，SA-β-gal)的活性。
　　9.3免疫荧光法测定各处理组细胞的DNA损伤标志物γ-H2AX及p-ATM的表达。
　　9.4免疫印迹法检测各处理组细胞的SIRT1、p53、p21蛋白表达水平。
　　所得结果分述如下:
　　第一部分 EFC对D-半乳糖致衰老大鼠氧化损伤的保护作用
　　结果:
　　1.D-gal模型组与对照组相比，脑组织SOD活性降低，MDA水平升高(P＜0.05); EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组与D-gal模型组相比，脑组织SOD活性明显升高而MDA水平显著下降(P＜0.05)。
　　2.D-gal模型组大鼠的心脏、肝脏、脾及胸腺系数明显降低，与对照组相比有统计学差异(P＜0.05);而EFC(400mg/kg)预防组和D-gal+EFC(400mg/kg)大鼠与D-gal模型组相比，上述各脏器系数明显升高(P＜0.05)。
　　3.大鼠海马CA1区锥体神经元HE染色结果显示，D-gal模型组与正常对照组相比，海马CA1区锥体神经元结构松散、排列稀疏，大部分细胞胞核出现核固缩，染色加深;D-gal+EFC（400mg/kg）组大鼠海马CA1区锥体神经元较D-gal模型组排列紧密，出现核固缩的细胞数量明显减少;EFC(400mg/kg)预防组大鼠海马CA1区锥体神经元形态基本正常，但锥体细胞层数较正常对照组少且细胞排列稍显疏松。
　　结论:
　　1.EFC可通过提高大鼠抗氧化能力，有效改善D-gal引发的衰老相关症状。
　　2.EFC可通过提高脾和胸腺系数增强大鼠的免疫功能，从而延缓大鼠衰老。
　　3.EFC能减轻D-gal对大鼠海马CA1区锥体神经元造成的损伤。
　　第二部分 EFC对D-半乳糖致衰老大鼠空间学习记忆障碍的改善作用
　　结果:
　　1.空间定向航行实验结果显示，各组大鼠在第1天测试中的搜台潜伏期和到达平台的距离无显著差异。但第2天到第5天测试结果显示，D-gal组大鼠的搜台潜伏期和到达平台距离与对照组相比，明显延长(P＜0.05)。EFC(400mg/kg)预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组大鼠的搜台潜伏期和到达平台距离与D-gal组相比，显著缩短(P＜0.05)。
　　2.定向航行训练第5天，各组大鼠的游泳轨迹显示，D-gal模型组的游泳轨迹杂乱无序，运动轨迹随机分布于各个象限;而EFC(400mg/kg)预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组的游泳轨迹接近正常对照组，搜索平台的策略明显改善，其运动轨迹多位于原平台位置所在象限或相邻的象限。
　　3.空间探索测试中，D-gal模型组大鼠穿越原平台位置的次数明显减少，在原平台象限停留的时间也显著缩短(P＜0.05)。而EFC(400mg/kg)预防组和D-gal+EFC(400mg/kg)组大鼠与D-gal模型组相比，穿越原平台位置的次数明显增加，在原平台象限停留的时间延长(P＜0.05)。
　　4.D-gal模型组大鼠海马齿状回GFAP和γ-H2AX阳性表达的细胞数量，与正常对照组相比明显增多(P＜0.05)，而EFC（400mg/kg）预防组和D-gal+EFC(400mg/kg)组大鼠GFAP和γ-H2AX阳性表达的细胞数量与D-gal模型组相比则明显减少(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.EFC可提高大鼠在Morris水迷宫测试中的各项成绩，对D-gal引起的空间学习及记忆损伤有一定的改善作用。
　　2.EFC可通过抑制大鼠海马齿状回星形胶质细胞的活化，减少GFAP的阳性表达来达到保护海马神经元的作用，从而提高大鼠的空间学习和记忆能力。
　　3.EFC可通过减轻大鼠海马齿状回细胞的DNA损伤，使γ-H2AX焦点的数量减少，进而改善大鼠的学习和记忆能力。
　　第三部分 EFC对D-半乳糖致衰老大鼠APP、Tau及PS1基因的影响
　　结果:
　　qRT-PCR检测结果显示，与对照组相比，D-gal组海马组织的APP、Tau、PS1 mRNA的相对表达量显著升高(P＜0.05);与D-gal组相比，EFC(400mg/kg)预防组和D-gal+EFC(400mg/kg)组大鼠海马组织中的APP、Tau、PS1 mRNA的相对表达量则显著下降(P＜0.05)。
　　结论:
　　EFC可下调大鼠海马组织APP、Tau、PS1基因mRNA的表达，进而延缓D-gal致衰老大鼠的神经退行性病变，改善认知功能。
　　第四部分 EFC对D-半乳糖致衰老大鼠Tau，PS1蛋白表达的影响
　　结果:
　　免疫印迹检测结果显示，D-gal模型组海马组织Tau蛋白S396位点的磷酸化程度及PS1蛋白的表达水平与正常对照组相比明显升高(P＜0.05)，而EFC(400mg/kg)预防组和D-gal+EFC（400mg/kg）组与D-gal模型组相比，海马组织Tau蛋白S396位点的磷酸化程度与PS1蛋白表达水平明显下降(P＜0.05)。但各组间总Tau蛋白表达水平没有显著差异。
　　结论:
　　EFC可能通过下调Tau蛋白磷酸化程度及PS1蛋白的表达水平，以此发挥延缓脑老化的作用，改善D-gal所致的空间学习和记忆障碍。
　　第五部分 EFC对SIRT1表达及p53-p21途径的影响及其机制
　　结果:
　　1.ROS荧光探针(DHE)检测结果显示，与对照组相比，D-gal(400mM)处理组细胞产生的ROS荧光信号显著增强，EFC（50μg/ml）预处理24h后，ROS荧光信号明显减弱。FACS流式细胞仪定量检测结果表明，D-gal处理组细胞ROS生成百分比最高达45.2％，对照组为1.4％，D-gal+EFC组及EFC组分别为3.2％和2.5％。
　　2.D-gal处理组的衰老细胞明显增多，40％的3T3细胞SA-β-gal染色阳性;而D-gal+EFC组及EFC组与D-gal处理组相比，SA-β-gal染色阳性的细胞数量明显减少。
　　3.免疫荧光染色结果显示，D-gal(400mM)处理后细胞的γ-H2AX焦点数量增加、p-ATM显色加强，而用EFC（50ug/ml）预处理细胞24h后，D-gal+EFC组及EFC预防组γ-H2AX焦点数量减少、p-ATM显色明显减弱。
　　4.免疫印迹试验检测结果显示，与对照组相比，D-gal处理组NIH/3T3细胞的SIRT1表达水平降低，p53、p21表达水平明显升高(P＜0.05)，而EFC预处理细胞24h后，D-gal+EFC组及EFC组的SIRT1表达上调，p53、p21表达显著下降(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.EFC可能通过提高NIH/3T3细胞的抗氧化能力而抑制ROS的生成，进而延缓细胞老化，使SA-β-gal表达下调;提高DNA损伤修复能力从而减轻D-gal诱发的细胞DNA损伤，使DNA损伤标志物γ-H2AX及p-ATM表达降低。
　　2.EFC可能通过上调NIH/3T3细胞的SIRT1表达水平而降低衰老相关蛋白p53、p21的表达，进而发挥延缓细胞衰老的作用。

目录

声明

个人简历

中英文缩略词汇对照表

摘要

前言

参考文献

第一部分 火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠氧化损伤的保护作用

材料与方法

材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分 火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠空间学习记忆障碍的改善作用

材料与方法

材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠APP、Tau及PS1基因表达的影响

材料与方法

材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分 火麻仁提取液对D-半乳糖致衰老大鼠Tau蛋白及PS1蛋白表达的影响

材料与方法

材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

第五部分 火麻仁提取液对SIRT1表达及p53-p21途径的影响及其机制

材料与方法

材料

实验方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述 衰老机制及老年性痴呆治疗方法研究进展

攻读学位期间发表的学术论文目录

致谢