重组人可溶性Tim-3原核表达载体的构建及其重组蛋白的优化表达

摘要

目的:
　　1、克隆人Tim-3基因胞外段序列，构建人可溶性Tim-3（sTim-3）的重组质粒表达载体pET28a-sTim-3-EGFP。
　　2、重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达，并对其表达条件进行优化，以获得较多可溶性的EGFP-sTim-3融合蛋白。
　　方法:
　　按照Trizol试剂说明书(Invitrogen)取健康人外周血单个核细胞提取总RNA，按照逆转录试剂说明书(Takara)构建人Tim-3基因的cDNA文库。根据Genebank中Tim-3序列结合跨膜预测软件设计Tim-3胞外段上下游引物，RT-PCR扩增Tim-3基因的胞外段片段sTim-3。产物与pMD18-T载体(Takara)连接转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄西林(Amp)筛选阳性克隆，进行菌液PCR、提取质粒双酶切鉴定，后选取阳性克隆菌液送公司测序。对阳性菌株所提质粒及已构建好的原核表达载体pET28a-EGFP质粒进行相同内切酶双酶切和琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，将纯化回收的sTim-3片段和EGFP-pET28a片段连接构建pET28a-sTim-3-EGFP重组质粒。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α进行卡那霉素(kan)抗性筛选，挑取单菌落培养，经PCR、双酶切及测序鉴定阳性克隆。提取鉴定阳性的重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆菌株培养进行PCR和双酶切验证。荧光显微镜下确定荧光较强的单菌落培养菌液行IPTG诱导表达，并进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色和Western blot检测以验证目的蛋白。通过调整IPTG浓度、诱导时机、诱导温度与诱导时间优化蛋白表达条件。
　　结果:
　　1、应用RT-PCR技术，从人外周血单个核细胞总RNA中扩增得到约620 bp的Tim-3基因的胞外段，与载体pET28a-EGFP连接，对重组体进行的菌液PCR、双酶切验证和测序分析结果表明:成功构建了原核表达载体pET28a-sTim-3-EGFP。
　　2、重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。诱导前后荧光显微镜的对比观察显示诱导后绿色荧光明显增强，SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色以及采用His标签单抗和EGFP标签单抗进行的Western blot检测验证了约为50.0 KDa的sTim-3-EGFP融合蛋白的表达。
　　3、蛋白表达条件优化的SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色结果显示一定范围内的IPTG浓度对蛋白表达量没有影响;温度对蛋白表达量影响不大;在培养至A600值约为0.6～0.8时于25℃诱导5h可获得较高的蛋白表达。
　　结论:
　　成功构建高效表达可溶性 Tim-3的原核表达载体pET28a-sTim-3-EGFP，表达的重组蛋白sTim-3-EGFP大小和预期相符，且为可溶性表达，为该蛋白的进一步纯化生产、应用及sTim-3的功能研究奠定良好基础。

目录

声明

个人简历

摘要

前言

1 材料

1．1 菌种及质粒

1．2 主要实验试剂

1．3 主要试剂的配制方法

1．4 主要设备和仪器

2 方法

2．1 引物的设计

2．1．1 Tim-3胞外段PCR引物的设计

2．1．2 EGFP片段PCR引物的设计

2．2 总RNA的提取

2．2．1 全血样本的淋巴细胞分离

2．2．2 RNA提取

2．3 RT-PCR扩增sTim-3片段

2．3．1 逆转录扩增cDNA

2．3．2 POR扩增sTIM-3片段

2．4 sTim-3片段的鉴定与纯化回收

2．4．1 琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物

2．4．2 纯化PCR产物

2．5 感受态大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)的制备

2．6 T载体克隆的构建与鉴定

2．6．1 T载体与sTim-3片段的连接、转化

2．6．2 转化产物的菌液POR鉴定

2．6．3 提取重组质粒

2．6．4 重组质粒的双酶切鉴定

2．6．5 测序鉴定

2．7 pET28a-sTim-3-E6FP重组质粒的构建与鉴定

2．8 sTim-3-EGFP融合蛋白的诱导表达与鉴定

2．8．1 重组蛋白的初步诱导观察

2．8．2 重组蛋白的SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色观察

2．8．3 重组蛋白的Western blot分析

2．9 sTim-3-EGFP融合蛋白诱导表达条件的优化

2．9．1 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导表达的IPTG浓度最佳化

2．9．2 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时机最佳化

2．9．3 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时间及温度最佳化

3 结果

3．1 Tim-3胞外段基因的RT-PCR结果

3．2 T载体构建质粒的验证

3．3 重组质粒pET28a-sTim-3-EGFP的鉴定

3．4 IPTG诱导表达前后菌液的对比观察

3．5 sTim-3-EGFP重组蛋白的鉴定

3．6 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导表达的IPTG浓度最佳化

3．7 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时机的最佳化

3．8 sTim-3-EGFP重组蛋白的诱导时间及温度最佳化

4 讨论

参考文献

附录

综述Tim-3及其在肿瘤治疗中的作用研究进展

攻读学位期间发表的学术论文情况

致谢