TNF--α通过miR--145--5p下调Cyr61表达抑制人绒毛膜滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞侵袭能力的研究

摘要

目的： 子痫前期(PE)是一种妊娠特有的临床疾病，其发病机制尚不清楚，临床治疗手段有限。因此深入研究PE的发病原因，为PE的早期诊断和有效地治疗提供依据就显得尤其重要。绒毛膜外滋养细胞浸润过浅是PE发病的主要原因，细胞迁移和侵袭能力受到多种分子和信号通路影响，筛选影响PE发生发展的分子将有助于深入理解PE的发病机制。人绒毛膜外滋养层细胞系HTR8/SVneo细胞来源于早孕期滋养层细胞，具有绒毛膜外滋养细胞的特性，被大量的应用于滋养细胞的生物学活性的研究，国内外关于子痫前期的研究多数以HTR8/SVneo细胞作为细胞模型。本研究的目的是以HTR8/SVneo细胞为模型，研究TNF-α/miR-145-5p/Cyr61轴对HTR8/SVneo侵袭和迁移能力的影响，并着重探讨其中的分子机制，以期为子痫前期在临床上的抗TNF-α治疗提供依据，并试图为临床上子痫前期的早期诊断提供分子标志，为子痫前期的临床治疗提供靶标。 方法： (1)分别利用转化生长因子-β(TGF-β)、溶血磷脂酸(LPA)、白介素35(IL-35)和肿瘤坏死因子(TNF-α)处理HTR8/SVneo细胞，利用划痕实验检测上述因子对HTR8/SVneo细胞迁移能力的影响，根据实验结果选择对HTR8/SVneo细胞迁移能力影响较大的细胞因子进一步研究分子机制。(2)根据筛选结果，选择TNF-α做进一步研究，筛选TNF-α影响HTR8/SVneo细胞迁移能力的下游分子，使用不同浓度TNF-α处理HTR8/SVneo细胞，分别利用real time RT-PCR和Western blotting在mRNA和蛋白水平检测侵袭相关转录因子MSH同源盒蛋白2(MSX2)、叉头框蛋白M1(FOXM1)、转录因子插头框蛋白O1(FOXO1)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)和富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)等分子的表达情况。(3)依据筛选结果，确定Cyr61为TNF-α影响HTR8/SVneo细胞迁移能力的主要下游分子，利用基因克隆技术分别构建Cyr61慢病毒表达载体和Cyr61靶向shRNA表达载体，转染HEK293细胞包装成慢病毒颗粒，感染HTR8/SVneo细胞，利用划痕实验、Transwell等检测Cyr61对细胞迁移和侵袭能力的影响。(4)进一步证实探讨TNF-α影响Cyr61表达的分子机制，利用生物信息学和real time RT-PCR技术筛选TNF-α处理HTR8/SVneo细胞后，miRNAs的表达谱变化，筛选到miR-145-5p在TNF-α处理HTR8/SVneo细胞后升高;利用生物信息学和双荧光素报告系统验证miR-145-5p对Cyr61mRNA沉默作用;利用合成miR-145-5p mimics、anti-miR-145-5p分别转染HTR8/SVneo细胞，Western blotting实验用来检测转染后HTR8-SVneo细胞中Cyr61的表达情况。利用划痕实验、Transwell等检测转染细胞迁移和侵袭能力变化。在HTR8/SVneo细胞中转染miR-145-5p inhibitor48h后，用10ng/mL TNF-α处理:划痕实验和Transwell实验用来检测TNF-α处理的HTR8/SVneo细胞中降低miR-145-5p表达对TNF-α介导的侵袭抑制的影响; 结果： (1)分别利用不同浓度TGF-β、LPA、IL-35和TNF-α处理HTR8/SVneo细胞24h后，划痕实验结果表明，TGF-β、LPA和IL-35对细胞的迁移能力没有明显影响，但是，终浓度为10ng/ml和100ng/ml的TNF-α可以显著抑制细胞的侵袭能力(P＜0.05)。(2)real time RT-PCR结果表明，TNF-α处理的HTR8/SVneo细胞中侵袭相关转录因子Msx2、FOXO1、FOXM1、STAT3和Cyr61mRNA表达均没有明显变化;Western blotting结果显示，TNF-α处理的HTR8/SVneo中侵袭相关转录因子Msx2、FOXO1、FOXM1和STAT3的表达没有显著变化，但是Cyr61蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。(3)成功构建了Cyr61表达载体（pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-Cyr61）和Cyr61靶向shRNA表达载体(pLKO.1-Cyr61-shRNA-1和pLKO.1-Cyr61-shRNA-2)，并包装成重组慢病毒颗粒，感染HTR8/Svneo细胞;real time RT-PCR和Western blotting的检测结果表明，在感染pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro-Cyr61重组慢病毒的HTR8/SVneo细胞中Cyr61在mRNA和蛋白水平表达均显著升高(P＜0.05)。而在两株敲低细胞系中，Cyr61在mRNA和蛋白水平表达均显著降低(P＜0.05)，而且pLKO.1-Cyr61-shRNA-1比pLKO.1-Cyr61-shRNA-2的效果要强。因此，我们用pLKO.1-Cyr61-shRNA-2稳转的细胞做后续实验。划痕实验结果显示，过表达Cyr61能够促进HTR8/SVneo细胞的迁移率(P＜0.05)，而敲低Cyr61的表达则能够显著抑制HTR8/SVneo细胞的迁移率(P＜0.05)。Transwell侵袭实验，我们得到了相似的结果。划痕实验和Transwell侵袭实验还显示，与转染载体的对照组细胞相比，过表达Cyr61的HTR8/SVneo细胞对TNF-α诱导的迁移和侵袭抑制具有明显的翻转效应。(4)real time RT-PCR结果显示，与对照组相比较，TNF-α处理的HTR8/SVneo细胞中miR-145-5p表达显著增加(P＜0.05);利用生物信息学方法分析结果显示，Cyr61-3'UTR与miR-145-5p有8nt碱基可以互补配对。双荧光素酶报告系统检测结果显示miR-145-5p mimics可以结合Cyr61-3'-UTR并抑制基因表达;转染miR-145-5p mimics后，real time RT-PCR结果显示，miR-145-5p的表达大约是原来的83倍;Western blotting结果表明，在转染miR-145-5p mimics的细胞中，Cyr61的表达显著下降，只有原来的26％左右;划痕实验和Transwell实验结果显示在HTR8/SVneo细胞中转染miR-145-5p mimics能够显著抑制HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭（P＜0.05），相反，转染miR-145-5p inhibitor则可以显著增强HTR8/SVneo细胞的迁移和侵袭(P＜0.05)。而用miR-145-5p inhibitor转染HTR8/SVneo细胞48h后的划痕实验和Transwell实验结果表明，miR-145-5p inhibitor能够逆转10ng/ml TNF-α诱导的HTR8/SVneo细胞迁移和侵袭能力的降低（P＜0.05）。 结论： TNF-α能够上调miR-145-5p的表达，miR-145-5p过表达可以降低Cyr61蛋白的表达。miR-145-5p能够抑制HTR8/SVneo细胞的侵袭。Cyr61可以翻转TNF-α介导的对HTR8/SVneo细胞的侵袭的抑制作用。TNF-α通过上调miR-145-5p进而靶向调控Cyr61的表达从而发挥抑制HTR8/SVneo细胞的侵袭的作用。