山楂叶总黄酮通过下调TLR4/NF--κB信号通路减轻脊髓损伤大鼠急性炎症反应

摘要

目的:脊髓损伤是指高能量外力以不同途径作用于脊柱，使脊柱移位、爆裂，进而累及椎管内脊髓。对脊髓的神经系统形成损害，作用于损伤部位调节的躯干使其不被大脑控制，造成躯体的感觉和运动功能损伤。这会为伤者，家人和社会引发无穷的后患。现今治疗脊髓损伤的临床药物种类很少，毒副作用明显，长效疗效不明确，并且一部分药物价格高昂，导致伤者无法持续负担。因此，寻找一种天然、有效、安全和廉价的药物已成为脊髓损伤治疗的趋势。 植物化合物最主要的优点是毒副作用微小，安全可靠，价格低廉，这些优点使其成为目前治疗脊髓损伤药物的研究重点。本课题组有针对性的筛选了具有抗炎作用的植物化学物，发现主产于广西的药材广山楂叶的主要药理成分山楂叶总黄酮可能具有潜在的治疗脊髓损伤的作用。 为了验证山楂叶总黄酮是否具有治疗脊髓损伤的作用我们进行了预实验，明确了山楂叶总黄酮能明显改善受损后脊髓的运动功能，提高脊髓损伤后神经细胞的存活率，保护残存的神经元，下调炎性因子的表达，增加脊髓损伤修复相关蛋白的表达量。这些结果均提示山楂叶总黄酮具有改善损伤脊髓局部微环境，增强脊髓损伤后大鼠的运动功能等良好作用。验证了山楂叶总黄酮有望成为治疗脊髓损伤的有效药物。 本实验通过体内实验，探讨山楂叶黄酮对大鼠的继发性脊髓损伤的保护机制。在体外，进一步探讨了山楂叶总黄酮与小胶质细胞炎症反应激活的关系及可能的分子机制。 方法:1.体内实验(1)雌雄各半的成年SD大鼠饲养于SPF环境，体重均为250g±5g，随机分为三组:假手术组(Sham组)、脊髓损伤组(SCI组)、山楂叶黄酮治疗组(SCI+TFHL组)。(2)采用ALLEN'S打击法建立大鼠脊髓中度损伤模型，假手术组仅进行手术暴露，未损伤脊髓。山楂叶总黄酮治疗组在脊髓损伤后腹腔注射山楂叶总黄酮25mg/kg，其余两组注射等量生理盐水。(3)通过BBB评分观察大鼠脊髓运动功能的恢复。(4)联合多种染色结果观察脊髓损伤后的细胞形态和数量变化情况。(5)免疫荧光染色观察神经元轴突再生蛋白的表达水平。(6)Western-blot和PCR技术检测炎症反应因子IL6、IL1-β和TNF-α，通路蛋白TLR4和NF-κB-p65的表达水平。 2.体外实验(1)小胶质细胞的培养:10％胎牛血清混合1％的青链霉素作为BV2小胶质细胞的培养环境，细胞置于培养瓶中，培养于37℃、5％CO2的培养箱中。(2)将细胞分三组。空白组(Control组):正常培养;脂多糖组（LPS组）:模拟脊髓损伤后小胶质细胞的激活;山楂叶总黄酮给药组（LPS+TFHL组）:LPS激活细胞后，加入TFHL25μg/mL。(3)通过MTT实验评估药物对细胞的毒性;(4)共聚焦显微镜观察小胶质细胞未激活与激活状态的区别;(5)通过酶联免疫吸附技术和聚合酶链式反应获取通路下游炎性因子IL6、IL1-β和TNF-α的表达水平;(6)通过Western免疫印迹检测通路信号蛋白TLR4和NF-κB-p65的表达情况。 结果:(1)通过BBB评分曲线发现，假手术组分数较高，而脊髓损伤组和山楂叶黄酮治疗组分数均明显降低。但是山楂叶黄酮治疗组的分数高于脊髓损伤组。(2)HE染色发现脊髓损伤组脊髓组织结构混乱，大量炎性细胞浸润。山楂叶总黄酮治疗组脊髓组织结构改善，炎症细胞浸润明显减少。(3)Western免疫印迹和PCR检测表明，山楂叶总黄酮治疗组中IL6、IL1-β和TNF-α蛋白和基因的表达水平均低于脊髓损伤组。(4)免疫荧光和免疫组化结果发现对比脊髓损伤组，山楂叶总黄酮治疗组通路蛋白TLR4和NF-κB-p65表达量下降。(5)通过尼氏染色明确了脊髓损伤组尼氏小体数量减少，形态较难辨认;而山楂叶总黄酮治疗组尼氏小体数量增加，形态改善。(6)经TUNEL染色发现，对比脊髓损伤组，山楂叶总黄酮治疗组细胞数量明显增多。(7)免疫荧光测定发现对比脊髓损伤组，山楂叶总黄酮治疗组的神经丝蛋白和神经营养因子含量明显增高。(8)在体外实验中对比脂多糖组，山楂叶总黄酮给药组的炎性因子IL6、IL1-β和TNF-α蛋白和mRNA表达均明显降低。(9)对比脂多糖组，山楂叶总黄酮给药组细胞活化现象受到明显抑制，TLR4和Iba-1荧光强度降低。(10)体外实验发现对比脂多糖组，山楂叶总黄酮给药组通路蛋白TLR4和NF-κB-p65的表达水平明显降低。 结论:(1)在体内实验中，发现山楂叶总黄酮可以降低炎症因子的表达水平，改善损伤脊髓局部微环境，减少神经细胞的死亡率，增强脊髓轴突再生，加快大鼠运动功能的恢复。(2)在体外实验中，发现山楂叶总黄酮可以抑制小胶质细胞的活化，降低通路蛋白和炎症因子的表达水平，从而抑制TLR4/NF-κB信号通路，发挥抗炎和神经保护效应。(3)山楂叶总黄酮可能成为一种新的治疗继发性脊髓损伤的药物。