硝酸银诱导的全雌系苦瓜花性别分化研究

摘要

苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科苦瓜属一年生蔓性草本植物，起源于东南亚。苦瓜作为药食兼用的保健蔬菜，在我国南方农业生产和人民生活中占有重要地位。苦瓜属异花授粉作物，具有明显的杂种优势。杂交制种时需绑花做标记和套袋隔离，工作量大而繁琐，在一定程度上制约了苦瓜杂种优势的利用。以全雌系苦瓜为母本杂交制种虽然具有操作简便和降低成本等优点，但是存在由于全雌系苦瓜本身不开雄花导致的自身繁殖困难问题。为了最大限度地提高AgNO3诱导的全雌系苦瓜自繁率和研究AgNO3诱导花性别分化过程的激素变化和差异基因表达，本文以全雌系苦瓜‘X—黑—d—d’为试材，从形态、生理和分子水平分析该过程，取得如下结果：
　　 1.为了最大限度地提高全雌系苦瓜繁殖率，本研究采用不同浓度的AgNO3和不同处理次数对不同发育阶段的全雌系苦瓜幼苗进行了化学诱雄试验。结果表明，在三叶一心到四叶一心期用300 mg/L AgNO3处理2次能成功诱导令雌系苦瓜从第1朵花开始连续性转化为花粉有活力的两性花，两性花平均为11.83朵/株，雄化时间7.6～8.6天，之后恢复为全雌花；而且三叶一心期是AgNO3诱导苦瓜雄化的关键时期。
　　 2.利用cDNA—AFLP技术研究AgNO3诱导全雌系苦瓜两性花分化过程差异基因表达的结果表明，36对引物组合共获得84个AgNO3处理后增强和特异表达的转录本片段(transcript—derived fragments，TDF)，约占总条带数的2.2％。其中20个经反向Northern杂交验证，18个TDF为阳性。经克隆、测序和在线比对，8个阳性TDF的核苷酸序列在GenBank中与已知功能基因有较高同源性，功能涉及调节激素平衡、RNA加工修饰、基因表达调控和能量代谢等；2个阳性TDF核苷酸序列与功能未知蛋白有同源性序列；7个阳性TDF与已知表达序列标签有同源序列，但功能未知：1个阳性TDF无任何同源序列，预测是功能未知基因。这些结果表明AgNO3诱导表达的这些阳性TDF参与了信号转导、基因表达调控和能量代谢等性别分化过程。
　　 3.为研究AgNO3诱导的全雌系苦瓜两性花分化与幼叶和花蕾中内源激素的关系，本研究采用酶联免疫检测技术(enzyme—linked immunosorbent assays，ELISA)测定三叶一心期苦瓜喷施蒸馏水和.AgNO3后72h内花蕾和新生叶片中内源激素含量。结果显示，喷施AgNO3后幼叶中IAA、GA3、ZR和ABA含量与喷水的相比，都是先下降后增加。AgNO3处理的花蕾中这4种激素含量在72h内没有一致变化规律，但变化幅度大于幼叶的，表明生殖器官的内源激素对苦瓜性别分化影响比营养器官的大。AgNO3处理后花蕾中单一激素含量表现出动态平衡。AgNO3处理后24～48h内，花蕾中这4种激素含量明显低于喷水的，而其余时间则高于喷水的，此外，AgNO3处理的花蕾中ABA/IAA、ZR/IAA和GA3/IAA比值也在24～48h发生剧烈的变化，48h之后这些激素比值与喷水的相差不大，表明AgNO3处理后24～48h是性别分化的关键时期，IAA可能是AgNO3诱导纯雌系苦瓜雄性分化的关键激素。
　　 4.利用RT—PCR(Reverse transcription PCR)和RACE(Rapid—amplification of cDNAends)技术从全雌系苦瓜花蕾中克隆了一个cDNA全长为1137bp的ACO基因，命名为Mc—AC01(GenBank登录号：FJ459813)。该基因包含1005 bp的完整开放阅读框、45 bp5’端非翻译区和Poly(A)在内的87 bp3’端非翻译区。完整开放阅读框推测编码334个氨基酸的蛋白，分子量(MW)为37.30 kDa，等电点(pI)为6.02。BLAST结果表明，苦瓜Mc—AC01在核苷酸与氨基酸水平上分别和GenBank中其他物种ACO基因同源性达73％～80％和77％～85％，说明植物.ACO基因在系统进化上相对保守。多序列比较结果表明，Mc—AC01功能区域的氨基酸序列较为保守，N—端区域的差异很大，C—端区域的差异较小；Mc—AC01含有已报道植物ACC氧化酶基因的6个保守区和7个二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶家族成员中保守存在的氨基酸残基，缺失1个保守区和2个保守的二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶家族成员中氨基酸残基。Mc—AC01在系统进化上与雌性系黄瓜雌性分化相关的Cs—AC03基因聚为一大类，表明Mc—AC01可能是苦瓜雌性分化相关的ACO基因家族一个成员。这为进一步研究AgNO3诱导全雌系苦瓜两性花分化与ACC氧化酶基因表达之间关系提供了基础。
　　 5.利用RT—PCR技术从全雌系苦瓜幼苗花蕾中克隆了一个cDNA全长为1604 bp的ACS基因，命名为Mc-ACS4(GenBank登录号：FJ459814)。该序列包含1455 bp的完整开放阅读框、30 bp5’端非翻译区和119 bp3’端非翻译区。完整开放阅读框推测编码484个氨基酸的蛋白，分子量(MW)为54.02 kDa，等电点(pI)为6.23。BLAST结果表明，苦瓜.Mc—ACS4在核苷酸与氨基酸水平上分别和GenBank中植物ACS基因同源性达73％～99％和64％～99％，说明植物ACS基因在系统进化上相对保守。苦瓜Mc—ACS4与苦瓜Mc—ACS3基因仅存在2个氨基酸差异，同源性高达99％。多序列比较结果表明，Mc—ACS4功能区域的氨基酸序列保守度高，N—端区域的差异较小，C—端区域的差异很大；Mc—ACS4含有已报道的ACC合成酶基因有7个保守区和11个保守氨基酸残基。Mc—ACS4在系统进化上与乙烯诱导冬瓜表达的ACS基因聚为一类，表明.Mc—ACS4可能是乙烯诱导表达的ACS基因。这为进一步研究AgNO3诱导全雌系苦瓜两性花分化与ACC合成酶基因表达之间关系奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1前言

1.1植物性别研究概况

1.1.1植物性别类型

1.1.2植物性别类型的分布

1.1.3植物性别的进化

1.1.4植物性别的主要特点

1.2高等植物性别分化

1.2.1高等植物性别的形态及解剖学研究

1.2.2高等植物性别表现的遗传基础

1.2.3高等植物性别分化的生理生化基础

1.2.4环境等因子与高等植物性别分化

1.2.5植物性别分化程序

1.3国内外苦瓜性别分化研究动态

1.3.1国内外苦瓜性别分化的研究现状

1.4 cDNA-AFLP技术的原理及其应用

1.4.1 cDNA-AFLP技术的原理与方法

1.4.2 cDNA-AFLP技术的特点

1.4.3 cDNA-AFLP技术的应用

1.5苦瓜性别调控存在问题

1.6本研究的目的和意义

2硝酸银诱导全雌系苦瓜两性花分化的化学调控

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.2处理和观察

2.1.3雄蕊形态观察和花粉活力鉴定

2.1.4数据统计

2.2结果与分析

2.2.1植株形态变化

2.2.2花性分布变化

2.2.3花发育及两性花子房的形态特征

2.2.4诱雄结果

2.3讨论

2.3.1 AgNO3浓度对全雌系苦瓜诱雄的影响

2.3.2处理时期对全雌系苦瓜诱雄的影响

2.3.3处理次数对全雌系苦瓜诱雄的影响

3 AgNO3诱导全雌系苦瓜两性花分化过程的基因差异表达

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1 RNA提取和dscDNA合成

3.2.2酶切及连接

3.2.3预扩增和选择性扩增体系的优化

3.2.4对照和处理混合花蕾的cDNA-AFLP分析

3.2.5不同时期花蕾基因差异表达的cDNA-AFLP分析

3.2.6差异片段的反向Northern杂交分析

3.2.7阳性片断同源性比较

3.2.8部分已知功能TDFs序列及BLAST结果

3.4讨论

3.4.1 cDNA-AFLP差异片段假阳性

3.4.2影响模板质量的主要因素

3.4.3苦瓜花蕾基因差异表达

3.4.4 AgNO3诱导全雌系苦瓜两性花分化机制的初步推测

4 AgNO3诱导的全雌系苦瓜两性花分化与花蕾和幼叶中内源激素关系

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1新生叶片中内源激素含量的变化

4.2.2花蕾中内源激素含量的变化

4.2.3花蕾中ABA／IAA、ZR／IAA和GA3／IAA比值的比较

4.3讨论

5苦瓜ACC氧化酶基因克隆及序列分析

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.1.3生物信息学分析

5.2结果与分析

5.2.1苦瓜ACO基因第一片段扩增结果

5.2.2苦瓜ACO基因第二、三片段扩增及拼接结果

5.2.3苦瓜ACO基因3’RACE和5’RACE的扩增结果

5.2.4苦瓜ACO基因cDNA全长拼接结果

5.2.5苦瓜Mc-ACO1基因序列分析与功能预测

5.3讨论

5.3.1苦瓜Mc-ACO1基因的克隆

5.3.2苦瓜Mc-ACO1基因同源性比较

5.3.3苦瓜Mc-ACO1基因编码氨基酸、蛋白质特性和系统进化树分析

6苦瓜ACC合成酶基因克隆及序列分析

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2方法

6.2结果与分析

6.2.1苦瓜ACS基因第一片段扩增结果

6.2.2苦瓜ACS基因第二、三片段扩增及拼接结果

6.2.3苦瓜Mc-ACS4基因序列分析与功能预测

6.3讨论

6.3.1苦瓜Mc-ACS4基因的克隆

6.3.2苦瓜Mc-ACS4基因同源性比较

6.3.3苦瓜Mc-ACS4基因编码氨基酸、蛋白特性和分子进化

7小结与设想

7.1结论

7.2下一步工作设想

致谢

参考文献

附录