十字花科黑腐病菌一个运动相关新基因的鉴定及功能研究

摘要

运动是细菌的最基本行为之一。运动使得细菌可以有效地移向有利环境以及逃避有害环境，因此对细菌的生存有重要意义。研究发现，运动在病原菌早期侵染寄主过程中有重要作用。细菌的运动是一个复杂的细胞过程，需许多基因的共同参与。尽管已经鉴定了许多运动相关基因，但人们认为还有许多运动相关基因有待鉴定。
　　 十字花科黑腐病菌（Xanthomonas campestris pathvar campestris，Xcc）是一种能够在全球范围内引起十字花科黑腐病的重要病原细菌，也是研究微生物与寄主相互作用分子机理的重要模式细菌。虽然Xcc是能够运动的，但是目前该菌中只有少数几个运动相关基因得到鉴定。为了鉴定Xcc中参与运动的新基因，在本工作中，我们检测了野油菜黄单胞菌8004菌株（Xcc8004）突变体库各个突变体的运动能力。结果发现，在以完成运动能力检测的3647个基因的突变体中，有116个基因的突变体完全丧失运动能力，另外还有285个基因的突变的运动能力比野生型菌株显著降低。
　　 为了确证突变体表现为运动缺陷的基因就是运动相关基因，我们随机选择14个基因的突变体进行功能互补。由于时间的关系，目前只完成了XC2182的Tn5突变体108C03的功能互补，其它基因的突变体的互补菌正在构建中。对108C03的互补菌C2182的运动能力检测的结果显示，108C03的运动能力能被XC2182互补，说明XC2182是Xcc运动必须的。基因组注释结果显示XC2182编码一个未知功能的蛋白，进一步的BLAST结果显示XC2182同源蛋白存在于一些细菌中，但它们的功能都还不清楚。此外，我们还检测了XC2182突变体和互补菌的生长、致病能力、致病因子产生等其他表型。结果表明，除了参与细胞的运动外，XC2182还参与了Xcc的致病和胞外多糖的产生。这些结果揭示，XC2182在Xcc的运动和致病过程中有重要作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1细菌运动概述

1.1.1细菌的运动方式

1.1.2细菌鞭毛介导的运动机制

1.1.3 IV型菌毛介导的运动机制

1.1.4细菌中与运动相关基因的研究进展

1.2十字花科黑腐病菌简况

1.2.1 十字花科黑腐病菌的基因组研究简况

1.2.2十字花科黑腐病菌的致病因子

1.3本工作的目的和意义

1.3.1研究的目的和意义

1.3.2研究内容

第二章材料与方法

2.1材料

2.1.1供试菌株与质粒

2.1.2生化试剂与寄主材料

2.1.3常用抗生素

2.1.4本研究所用的引物

2.1.5细菌培养基及培养条件

2.1.6常用的试剂及缓冲液

2.2常规微生物学操作

2.2.1细菌培养条件及保存

2.2.2 提取DNA

2.2.3 DNA的纯化和沉淀

2.2.4 PCR扩增反应

2.2.5琼脂糖凝胶电泳

2.2.6从琼脂糖凝胶中分离和纯化DNA片段的回收

2.2.7载体脱磷酸化处理

2.2.8 DNA的酶切及产物纯化

2.2.9 DNA浓度和纯度

2.2.10 DNA的连接

2.2.11质粒DNA的转化

2.2.12三亲本接合方法

2.3运动性的检测

2.4基因突变体的互补

2.5表型检测方法

2.5.1植株致病性的检测

2.5.2过敏性反应(HR)检测

2.5.3主要致病因子的检测

2.6生物膜的检测

2.7突变体营养缺陷型检测

2.8Xcc生长曲线的测定

2.8.1丰富培养基(NYGB)上生长曲线的测定

2.8.2基本培养基(MMX)上生长曲线的测定

2.8.3寄主叶内生长曲线的测定

2.9基因生物信息学分析

第三章运动能力缺失突变体的筛选

3.1运动表型的检测

3.2运动表型初筛结果

第四章与运动相关的基因的确定

4.1 14个候选基因的互补试验

4.2 XC2182基因的互补实验

4.2.1 XC2182互补基因片段扩增结果

4.2.2重组质粒pL2182构建

4.2.3三亲本接合子的获得

4.2.2运动性检测

4.3互补菌株其他表型检测

4.3.1.致病性检测

4.3.2寄主体内生长的情况

4.3.3过敏反应的检测

4.3.4主要致病因子的检测

4.3.5在培养基上的生长情况

4.3.6对生物膜的影响

4.4XC2182基因的生物信息学分析

4.4.1 XC2182基因在基因组上的位置

4.4.2 XC2182基因的结构域分析

第五章结论与讨论

5.1关于与运动相关基因的筛选

5.2关于XC2182基因的鉴定

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况