广西猪乙型脑炎病毒的分离鉴定及血清流行病学调查研究

摘要

乙型脑炎( Japanese encephalitis， JE)由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus， JEV)引起，是世界上特别是亚洲东部和东南部最重要的病毒性脑炎之一，死亡率高达20-50％。JEV是一种蚊媒黄病毒，在蚊子、猪和水鸟中循环传播。在JE病例中，大部分的存活者尤其是儿童具有持久性的神经系统和精神病方面的后遗症。同时，JE还对养猪业造成了巨大的经济损失。JE已是一个主要的公共卫生问题。对于JE，迄今为止还没有特效疗法，预防是最好的防御措施。
　　 猪是JE最重要的传染源。为了了解广西猪JE的流行情况，更好地预防该病，我们进行了一系列的研究。
　　 首先，根据GenBank上登录的JEVE基因序列，设计了内外2对引物，以JEV疫苗株为模板，建立了检测猪JEV的套式RT-PCR(RT-nested-PCR)方法。应用该方法对JEV疫苗株RNA进行扩增，获得与预期大小相符，长度为228bp的目的片段；检出JEV-RNA的灵敏度约为0.3pg。应用该方法，对从广西各地猪场采集的142份猪脑组织、流产的仔猪死胎、种公猪精液、蚊子样品进行检测，结果有34份为JEV阳性。结果表明，所建立的RT-nested-PCR方法对JEV的检测敏感性高、特异性强、简便易行，是JE早期快速诊断的有力工具；广西JE感染率较高。
　　 其次，从检测得到的34份阳性样品中选择了1份死胎猪脑组织和1份种公猪精液分别接种BHK-21细胞、乳鼠及鸡胚进行JEV的分离。通过RT-nested-PCR检测、间接免疫荧光试验、病毒感染力(TCID50)的滴定、中和试验等的鉴定，证实所分离的两株为乙型脑炎病毒，分别命名为GP株和LC株。
　　 应用RT-PCR扩增出GP株和LC株的E基因，并进行了序列测定分析。遗传进化分析表明，分离得到的GP株和LC株均属于基因型Ⅲ型，与疫苗株SA14-14-2的亲缘关系最近。GP株和LC株之间的核苷酸和氨基酸同源性均为99.8％；GP株和LC株与疫苗株SA14-14-2的核苷酸同源性分别为99.7％和99.8％，氨基酸同源性分别为99.4％和99.6％。与疫苗株SA14-14-2的E蛋白相比较，GP株存在3个氨基酸差异；LC株有2个氨基酸差异。两个毒株E163位氨基酸的变异(Q→R)可能引起其抗原活性的改变。
　　 最后，应用猪乙型脑炎乳胶凝集试验抗体检测试剂盒对2008-2009年从广西12个市采集的1676份猪血清进行乙脑流行病学调查。结果，1676份血清中，JE抗体阳性923份，阳性率为55.1％，表明广西存在普遍的JE感染。不同地区、不同季节甚至不同年份，猪群JE抗体阳性率均有所不同，说明了广西猪JE感染具有一定的地域性、季节性。