H6亚型禽流感病毒病原学监测和快速诊断方法的研究

摘要

H6亚型禽流感病毒(AIV)属于低致病性A型流感病毒，水禽和野鸟是H6亚型禽流感病毒的主要宿主。H6亚型禽流感病毒可以感染哺乳动物，如鼠和水貂，甚至还有报道称在健康的青年体内检测到了H6亚型AIV的抗体。低致病性AIV通过基因重排等为H5N1等高致病性禽流感病毒提供基因，从而可能引起流感的流行。
　　 从2009年至2011年活禽市场采集样品中分离H6亚型禽流感病毒。用血凝抑制试验初步筛选，PCR方法进行进一步的确认检测，对NA基因进行序列测定。结果表明，2009年到2011年间的样品中共分离到7株H6亚型禽流感病毒，分别为1株H6N1，两株H6N2，一株H6N5，两株H6N6，一株H6N8。
　　 对分离到的7株鸭源H6亚型禽流感病毒的八个基因片段进行序列测定。完成7株H6亚型AIV的全基因测序后，将序列鉴定结果与GENBANK上的序列进行比对分析。结果表明，7株H6亚型AIV的八个基因片段均属于欧亚谱系，基因来源结构比较复杂。在HA1和HA2剪切位点，7株分离株的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G，仅含一个碱性氨基酸，都符合典型低致病性禽流感病毒特征序列。
　　 建立了检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，对反应条件和反应体系进行优化。结果表明该方法的特异性良好，对其他呼吸道病原体均无扩增反应。该方法灵敏度高，最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01pg，该方法无需特殊仪器，只需在水浴锅中进行，是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法。并且建立了H6亚型禽流感病毒(AIV)SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明，该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA，比RT-PCR灵敏度高出1000倍。对其他呼吸道病原体无扩增；检测快速，从样本处理到报告结果仅需3.5h。
　　 比较对H6亚型AIV建立的四种快速检测方法RT-PCR、巢式RT-PCR、实时荧光定量PCR和RT-LAMP四种方法的灵敏性。结果表明：四种方法中，实时荧光定量PCR的敏感性最高，其次为RT-L AMP和巢式RT-PCR，普通PCR敏感性最低。基层检验时可以根据需要和条件选择适合的检测方法，多种快速检测方法结合可以更好地确定诊断。

目录

文摘

英文文摘

前 言

第一章：文献综述

1 禽流感病毒的分子病原学研究进展

1.1 禽流感的流行概况和危害

1.2 禽流感病毒的概况

1.3 禽流感病毒的生物学特性

1.4 水禽和候鸟在禽流感传播中的作用

2 禽流感病毒的快速诊断方法研究进展

2.1 逆转录-聚合酶链式反应

2.2 逆转录-巢式聚合酶链式反应

2.3 逆转录-环介导等温核酸扩增技术

2.4 实时荧光定量RT-PCR

3 本课题的研究意义

第二章：H6亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 病毒分离结果

2.3 RT-PCR检测结果

2.4 毒株NA亚型的测定结果

2.5 H6亚型AIV病原性监测情况

2.5 鸡胚半数感染量(EID50)的测定和鸡胚半数致死量(ELD50)的测定结果

2.6 致病性实验结果

3 讨论

第三章：7株H6亚型禽流感病毒的全基因序列测定与序列分析

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 H6亚型AIV全基因RT-PCR扩增结果

2.27株毒株的个基因片段克隆和序列测定结果

2.37株H6亚型AIV全基因组序列分析

3 讨论

第四章：H6亚型禽流感病毒快速检测方法的建立

1.H6亚型禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

1.1 材料与方法

1.2 结果

1.3 讨论

2.H6亚型禽流感病毒SYBR Green I实时定量荧光PCR方法的建立

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第五章：H6亚型禽流感病毒四种核酸检测方法比较

1 材料与方法

1.1 毒株和主要仪器试剂

1.2 病毒RNA的提取

1.3 质粒与核酸的梯度稀释

1.4 核酸浓度测定

1.5 引物的合成

1.6 四种检测方法的最佳扩增条件

1.7 四种核酸扩增方法的检出限测定

1.8 临床样品的检测

2 结果

2.1 质粒标准品敏感性检测结果与病毒RNA敏感性检测结果

2.2 临床样品检测结果

3 讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历

攻读学位期间发表论文情况