红麻CMS系P3A及其保持系P3B花药线粒体差异蛋白质组学研究

摘要

细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility, CMS)是高等植物中普遍存在的一种生物学现象，关于CMS发生的分子机理，目前还不是很清楚。很多研究认为线粒体是CMS的载体，而蛋白质是生物功能的执行者，因此，开展线粒体蛋白质组学研究对于揭示细胞质雄性不育的机理具有重要意义。本研究以红麻细胞质雄性不育系P3A及其保持系P3B为材料，运用双向凝胶电泳技术对其双核期花药线粒体蛋白质组展开研究，对差异蛋白质点进行质谱鉴定。并针对蛋白质组学的结果对atp1基因的保守区进行克隆，获得了如下结果:
　　 1.运用IEF/SDS-PAGE双向凝胶电泳技术，获得了红麻细胞质雄性不育系P3A及其保持系P3B花药线粒体蛋白质的清晰凝胶电泳图谱，在分子量17-130KDa、等电点3-10范围内，大约可以识别1000个蛋白质点，利用ImageMaster2D platinum5.0软件分析结果表明:不育系和保持系线粒体蛋白质之间存在50个差异点。其中仅在不育系中特异表达的点7个，仅在保持系中特异表达的点4个，其他39个为量的差异，其中在不育系中上调表达的点23个，在保持系中上调表达的点16个。
　　 2.对50个差异蛋白质点采用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱进行肽指纹图谱分析(MADIL-TOF-TOF-MS)，获得了28个蛋白质点的肽指纹图谱，并用Mascot软件在NCBInr绿色植物数据库中比对，成功鉴定出24个蛋白质，分别为V-ATP酶B亚基，微管蛋白β-18，微管蛋白α-4，ATP合成酶α亚基，线粒体外膜蛋白，3个蛋白质点被鉴定为同一蛋白ATP合成酶F1亚基1，ATP合成酶β亚基，线粒体伴侣蛋白CPN60，过氧化物酶B，内质网结合蛋白2，磷酸甘油酸变位酶，琥珀酸脱氢酶，2个线粒体多肽加工酶β亚基，线粒体多肽加工酶α亚基，苹果酸脱氢酶，成熟酶K，半胱氨酸富集分泌蛋白38，3个假定蛋白和1个预测蛋白。这些蛋白质点主要涉及到能量代谢等过程，很可能与红麻细胞质雄性不育的发生有关。
　　 3.采用同源克隆的方法，根据Genbank里其它物种的atp1基因的保守区设计特异引物，利用PCR扩增获得了红麻细胞质雄性不育系P3A及其保持系P3B的atp1基因1045bp序列。对比发现，两者之间的差异不大，只有7个碱基不同，分别为P3A在第3位处由A→G，第58、616、1002位由C→T，第685位由T→C，第786、971位由G→A;而P3B则在第21位处缺失了1个碱基C和在1010位处缺失了1个碱基G，同源性达到99.14％。半定量RT-PCR结果表明，atp1基因的表达量在不育系和保持系之间没有明显差异。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 线粒体与细胞质雄性不育

1．1．1 线粒体的功能

1．1．2 线粒体基因组与细胞质雄性不育

1．1．3 线粒体嵌合基因与细胞质雄性不育

1．1．4 线粒体RNA与细胞质雄性不育

1．1．5 线粒体蛋白质与CMS

1．2 蛋白质组学概况

1．2．1 双向凝胶电泳技术

1．2．2 凝胶图像分析技术

1．2．3 质谱技术

1．2．4 蛋白质生物信息学

1．3 红麻细胞质雄性不育研究进展

1．4 研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 材料

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 不育系P3A及保持系P3B线粒体差异蛋白质组学研究

2．2．2 atp1基因克隆

2．2．3 atp1基因半定量RT-PCR分析

3 结果与分析

3．1 线粒体蛋白质组学研究

3．1．1 蛋白质的定量检测

3．1．2 红麻CMS系P3A及其保持系P3B花药线粒体蛋白二维电泳图谱

3．1．3 差异表达蛋白质点的质谱分析

3．1．4 差异蛋白质的鉴定分析

3．1．5 鉴定蛋白质的功能分类

3．1．6 差异蛋白质点的生物学功能分析

3．2 atp1基因克隆

3．2．1 线粒体DNA提取

3．2．2 atp1基因片段克隆与分析

3．3 atp1基因半定量RT-PCR分析

3．3．1 红麻花药总RNA提取

3．3．2 cDNA合成

3．3．3 atp1基因表达分析

4 讨论

4．1 红麻花药及黄花苗线粒体的提取方法

4．2 不育系与保持系线粒体差异蛋白质分析

4．3 差异蛋白质与红麻细胞质雄性不育关系分析

4．4 atp1基因克隆及表达分析

5 结论

6 展望

致谢

参考文献

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