非致病性尖孢镰刀菌CS-20诱导黄瓜抗枯萎病的分子机制研究

摘要

由致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的枯萎病为毁灭性土传病害，常造成严重减产甚至绝收。目前枯萎病的防治缺乏有效方法，如抗病品种和化学防治药剂，因此研究生物技术诱导植物产生抗病性成为防治作物枯萎病害的重要技术途径。非致病性尖孢镰刀菌株CS-20(Fusarium oxysporum CS-20)是从美国佛罗里达州的抑制西瓜枯萎病的土壤中分离而来，对作物枯萎病具有较好的防治效果，但是菌株CS-20诱导寄主植物产生的防御反应机制尚不明确，且菌株CS-20中哪些生防因子起作用以及它们诱导抗病的具体分子机理也未清楚，从而限制了菌株CS-20开发应用。因此，本研究以黄瓜感病品种9930和菌株CS-20为研究对象，一方面解析菌株CS-20诱导黄瓜植株产生防御反应机制;另一方面从菌株CS-20次生代谢物合成基因聚酮合成酶(polyketidebiosynthase，PKS)和非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，NRPS)中挖掘诱导抗病的关键效应基因并阐明其具体功能。主要取得以下结果:
　　1.明确感病黄瓜品种9930在根部接种菌株CS-20后，黄瓜苗产生的抗病反应机制。提前接种CS-20可诱导黄瓜苗产生抗病性，显著降低黄瓜苗的病情指数;荧光显微镜观察发现GFP(green fluorescent protein)标记菌株CS-20只侵入和定殖在黄瓜苗主根和侧根部表面，与黄瓜植株保持一个稳定的互生关系;接种菌株CS-20可激活黄瓜苗根部组织的水杨酸信号途径、茉莉酸信号途径和茉莉酸/乙烯信号途径，且特异性地诱导钙离子通道基因的上调表达。
　　2.基于菌株CS-20的全基因组测序结果，生物信息学分析预测到10个PKS基因，14个NRPS基因，3个PKS-NRPS杂合基因，3个DAMT(prenyltransferase)基因。qRT-PCR（quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction）分析结果表明:菌株CS-20和致病菌FOC-BN分别接种黄瓜苗根部72h后，侵入根部的两菌株中PKS-NRPS基因表达差异显著。比较发现:在菌株CS-20中有9个基因特异表达，其中4个基因(FOWE_10925、FOWE_10935、FOWE_01643、FOWE_09588)特异上调，5个基因特异下调(FOWE_00999、FOWE_12767、FOWE_03871、FOWE_06548和FOWE_11163)，推测它们可能与其诱导黄瓜苗植株产生系统抗病性相关;在致病菌FOC-BN中15个基因特异上调表达，推测它们可能与其致病性相关。
　　3.采用Split marker gene deletion method方法对菌株CS-20的9个可能与诱导抗病性相关基因进行敲除，结合PEG介导的原生质体遗传转化方法和潮霉素抗性筛选，并通过PCR和Southern bolt验证，获得了9个与诱导抗病性相关基因缺失突变体(ΔFOWE_00999(T87)、ΔFOWE_12767(T28)、ΔFOWE_03871(T19)、ΔFOWE_06548(T5)、ΔFOWE_10925(T17)、ΔFO WE_11163(T16)、ΔFOWE_10935(T13)、ΔFOWE_01643(T9)和ΔFOWE_09588(T20))。野生型菌株CS-20与突变体ΔFO WE_11163(T16)培养形态无明显差异，而与其它8个候选效应基因缺失突变体存在明显差异;9个候选效应基因缺失突变体和野生型菌株菌落生长直径每一天都存在明显差异(p＜0.05)，其中突变体ΔFOWE_10925(T17)和ΔFOWE_11163(T16)的生长速率与野生型相当，其它7个突变体的生长速率则均小于野生型菌株的生长速率。
　　4.采用挑战接种和split-root接种方法分析9个候选基因缺失突变体在诱导抗病水平上差异，其中6个突变体（ΔFOWE_00999、ΔFOWE_12767、ΔFOWE_03871、ΔFOWE_06548、ΔFOWE_10925和ΔFOWE_11163）接种后的病情指数显著高于野生型菌株CS-20，推断该6个候选效应基因与诱导黄瓜苗产生抗病性密切相关，为菌株CS-20诱导抗病的关键效应基因。相对于野生型菌株，6个关键效应基因突变体处理后黄瓜苗根部和叶部的NPR1基因的转录水平显著降低，与清水对照处理结果一致。在处理的黄瓜苗根部组织中，LOX1和 PAL1基因表达水平均显著低于野生型菌株，但PR3基因表达只在突变体ΔFOWE_12767处理显著降低;相对于根部组织，处理后叶部组织中只有茉莉酸/乙烯信号途径(PAL1)基因表达水平值差异较大，其它信号途径基因的转录水平在6个效应基因缺失突变体、野生型和清水处理之间整体上保持在一个水平曲线。
　　5.功能结构域分析表明:诱导抗病的6个关键效应基因均包含ketosynthase(KS)、acyl transferase(AT)、β-ketoreductase(KR)、dehydrogenase(DH)和enoyl reductase(ER),均属于HR(highly reducing)-PKSs类型，合成产物为线性碳链或非芳香烃类化合物。基于各功能结构域的蛋白序列构建的系统发育树表明:6个关键效应基因的各功能单元都各自处在一个小分支上，彼此之间亲缘关系较远。
　　6.菌株CS-20的PKS-NRPS基因合成产物预测分析发现6个关键效应基因均未见合成产物报道。采用液质联用仪检测了6个关键效应基因缺失突变体和野生型菌株发酵产物粗提物的成分，进一步差异比对和代谢物质谱数据库分析，推测关键效应基因FOWE_00999可能合成产物为11，12，13-trihydroxy-9-octadecenoic acid，分子式为C18H34O5;关键效应基因FOWE_12767可能合成产物为9，10，13-trihydroxy-11-octadecenoic acid(C18H34O5);关键效应基因FOWE03871可能合成产物为5-hydroxy-2-octadecenoic acid，分子式为C18H34O3;关键效应基因FOWE_06548未找到线性类差异化合物;关键效应基因FOWE10925可能合成产物为8-methoxy-13-hydroxy-9，11-octadecadienoic acid，分子式为C19H34O4;关键效应基因FOWE11163可能合成产物为10-hydroxy-undecanoic acid，分子式为C11H22O3。所推测的5个化合物为未知新化合物，是否作为诱导子具有诱导抗病作用需进一步验证。
　　本研究首先明确菌株CS-20根部接种后可诱导黄瓜苗本身产生防御反应机制;其次，以菌株CS-20切入点，创新性地从次生代谢物合成基因方面研究诱导抗病的关键效应的基因及其功能，并对关键效应基因的产物进行了初步鉴定。因此，本研究系统地阐明非致病尖孢镰刀菌CS-20诱导黄瓜抗枯萎病的分子机制，为生防菌防控枯萎病奠定了理论基础。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 研究意义

1．2 国内外研究现状

1．2．1 诱导抗性分子机制

1．2．2 植物主要防御措施

1．2．3 尖孢镰刀菌生物学特性

1．2．4 非致病性尖孢镰刀菌控制枯萎病

1．2．5 非致病性尖孢镰刀菌作用机制

1．2．6 应用非致病性尖孢镰刀菌作为生防菌

1．3 研究目的

第二章 由菌株CS-20根部定殖引起的黄瓜苗防御反应机理分析

2．1 材料与方法

2．1．1 供试菌株、黄瓜品种和培养基

2．1．2 菌株培养和接种体(尖孢镰刀菌分子孢子液)制备

2．1．3 黄瓜苗水培养

2．1．4 黄瓜苗接种尖孢镰刀菌接种体

2．1．5 黄瓜致病菌株FOC-BN致病性测定

2．1．6 GFP标记观察菌株CS-20和FOC-BN根部侵入定殖

2．1．6 挑战接种

2．1．7 黄瓜幼苗根收集和RNA提取

2．1．8 实时荧光定量(qRT-PCR)分析基因的表达量

2．1．9 统计分析

2．2 结果与分析

2．2．1 黄瓜致病菌FOC-BN致病性分析

2．2．2 菌株CS-20诱导黄瓜幼苗产生抗病性抵御致病菌危害

2．2．3 GFP标记菌株在黄瓜苗根部侵入定殖

2．2．4 比较分析两菌株接种72h后苗根部组织相关基因表达

2．2．5 上调表达基因表达模式分析

2．3 讨论

第三章 基于次生代谢物合成基因(PKS-NRPS)功能分析诱导抗病机制

3．1 材料与方法

3．1．1 供试菌株

3．1．2 供试培养基、质粒和配方液

3．1．3 菌株CS-20的次生代谢物合成基因(PKS-NRPS)预测

3．1．4 致病菌FOC-BN基因组与菌株CS-20的PKS-NRPS同源性基因

3．1．5 菌株CS-20与致病菌FOC-BN侵染黄瓜苗根

3．1．6 候选效应基因在接种黄瓜苗根部72h后转录水平

3．1．7 菌株CS-20上调表达基因不同时间点的转录水平

3．1．8 菌株CS-20基因组DNA提取

3．1．9 质粒培养及提取

3．1．10 PCR扩增片段回收

3．1．11 菌株CS-20中与诱导抗病性相关候选效应基因缺失突变体构建

3．1．12 相关候选效应基因缺失突变体生物学特性

3．1．13 相关候选效应基因缺失突变体诱导抗病性水平

3．1．14 黄瓜苗抗性信号途径基因表达

3．1．15 关键效应基因结构和蛋白单元分析

3．1．16 关键效应基因全基因簇预测分析(smurf软件预测)

3．1．17 数据统计

3．2 结果与分析

3．2．1 预测菌株CS-20次生代谢物合成基因(PKS-NRPS)

3．2．2 致病菌FOC-BN与菌株CS-20的PKS-NRPS同源性基因

3．2．3 比较分析菌株CS-20与致病菌FOC-BN的PKS-NRPS基因在接种黄瓜苗前后(72h)的转录水平

3．2．4 菌株CS-20中4个上调表达候选基因表达模式

3．2．5 菌株CS-20中9个PKS候选效应基因缺失突变体构建

3．2．6 各候选效应基因缺失突变体生物学特性

3．2．7 各候选效应基因缺失突变体诱导抗病水平

3．2．8 黄瓜苗抗性信号途径基因表达分析

3．2．9 关键效应基因结构和功能单元分析

3．3 讨论

3．3．1 非致病性尖孢镰刀菌CS-20与致病菌FOC-BN的PKS-NRPS基因比对

3．3．2 接种前后菌株CS-20与致病菌FOC-BN的PKS-NRPS基因表达差异

3．3．3 PKS类型效应基因关键作用

3．3．4 关键效应基因结构功能的特异

第四章 关键效应基因调控合成产物初步鉴定

4．1 材料与方法

4．1．1 供试菌株、培养基、仪器设备

4．1．2 供试菌株接种体制备

4．1．3 供试菌株发酵培养

4．1．4 供试菌株发酵物粗提物提取

4．1．5 基于野生型菌株CS-20次生代谢物合成基因预测产物

4．1．6 LC-MS检测各供试菌株粗提物组分

4．1．7 野生型与突变体菌株提取物组分差异分析及鉴定

4．2 结果与分析

4．2．1 野生型菌株CS-20次生代谢物预测分析

4．2．2 基于LC-MS分析野生型与突变体菌株提取物组分差异

4．3 讨论

第五章 总结

5．1 全文总结

5．2 论文的创新点

5．3 问题与展望

参考文献

致谢

作者在攻读博士学位期间科研、学术活动、论文发表和专利发明等情况

论文说明