Span/Tween改性磁性氧化石墨烯固定化脂肪酶的初步研究

摘要

脂肪酶(EC3.1.1.3)，具有反应条件温和，高度专一性，高催化效率和对环境友好等优势，在化学合成、生物降解等领域具有广泛应用。酶固定于载体后能提高酶的稳定性与可重复利用性。氧化石墨烯为单原子层二维结构，比表面积大，利于酶在载体表面的吸附以及底物与产物的传质，是一种有潜力的催化剂载体。本文以氧化石墨烯为基底材料，采用化学共沉淀法制备磁性氧化石墨烯(MGO)，同时采用不同的Span/Tween型表面活性剂对其进行改性，然后用于脂肪酶OF的固定化，初步探讨Span/Tween改性对于磁性氧化石墨烯固定化酶催化特性的影响。
　　采用不同的表面活性剂改性载体固定化酶，发现载体改性后蛋白固载量和固定化酶比活回收率都有所提高。与游离酶比活(12.90U·mg-1)相比，Span60改性载体固定化酶比活回收率最高，达到281.5％，比活为36.31U·mg-1。从固载量看，载体Span40改性后的蛋白固载量最高，达到114.36mg·g-1support。测定动力学参数，改性载体固定化酶的Km普遍减少，其中Span40改性载体固定化酶的Vmax和Km分别由游离酶的24.95U·mg-1、1.21mmol·L-1改变为43.07U·mg-1、0.46mmol·L-1，其催化效率（Kcat/Km）从24.95s-1/mM-1提高至93.56s-1/mM-1。固定化酶的pH适应性和热稳定性得到改善。重复使用5次后仍保持30.0％的活力，在室温贮藏31天后仍有56.1％的活力。
　　采用扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、X射线衍射仪(XRD)、热重分析(TGA)、傅里叶红外光谱(FT-IR)等表征手段探究载体与固定化酶的基本性质，发现磁性纳米Fe3O4与氧化石墨烯成功复合，表面活性剂成功包裹在载体表面，而脂肪酶也成功固定在改性载体上。
　　采用红外光谱进行蛋白二级结构分析与测定接触角，初步探究改性对酶催化特性的作用机理，发现载体疏水性与酶催化特性有一定关联，认为疏水性载体能促使脂肪酶构象发生变化，打开活性中心上的“盖子”。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 脂肪酶概述

1．1．1 脂肪酶的催化机理

1．1．2 脂肪酶的固定化

1．2 氧化石墨烯在固定化酶中的应用

1．2．1 氧化石墨烯简介

1．2．2 氧化石墨烯固定化酶的研究进展

1．3 表面活性剂在酶催化反应中的作用

1．3．1 表面活性剂对酶的影响

1．3．2 Span／Tween型表面活性剂简介

1．4 本课题研究的意义与内容

1．4．1 课题研究意义

1．4．2 课题研究内容

第二章 Span／Tween改性磁性氧化石墨烯固定化脂肪酶OF的研究

2．1 前言

2．2 实验试剂与仪器

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 表面活性剂结构式

2．3 实验方法

2．3．1 Span／Tween改性磁性氧化石墨烯的制备

2．3．2 脂肪酶的固定化

2．3．3 蛋白含量的测定

2．3．4 酶活性的测定

2．3．3 温度与pH对固定化酶活性的影响

2．3．4 固定化酶的重复利用性(p-NPP法)

2．3．5 固定化酶的热稳定性和储藏稳定性

2．3．6 固定化酶的动力学参数计算

2．4 结果与讨论

2．4．2 固定化酶的动力学参数

2．4．3 温度与pH对固定化酶活性的影响

2．4．4 固定化酶的重复利用性(p-NPP法)

2．4．4 固定化酶的热稳定性与贮藏稳定性

2．5 本章小结

3．1 前言

3．2 实验试剂与仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 实验方法

3．2．1 傅里叶红外光谱测定条件及方法

3．2．5 透射电镜测定条件及方法

3．4 结果与讨论

3．4．1 扫描电镜分析

3．4．2 透射电镜分析

3．4．3 X射线衍射仪分析

3．4．4 傅里叶红外光谱分析

3．4．5 热重分析

3．4．6 磁分离性能

3．5 本章小结

4．1 前言

4．2 实验试剂与仪器

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．3 实验方法

4．3．1 Span／Tween型表面活性剂对酶活性的影响研究

4．3．2 接触角的测定及对酶活影响分析

4．3．3 ATR-FTIR光谱对酶二级结构的分析

4．4 结果与讨论

4．4．1 Span／Tween型表面活性剂对酶活性的影响研究

4．4．2 改性MGO表面亲疏水性对酶活性的影响

4．4．3 ATR-FTIR对酶二级结构的分析

4．5 本章小结

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

附录

致谢