钙离子介导的卵母细胞冻融性损伤的初步研究

摘要

卵母细胞冷冻复苏后的复苏率、受精率、胚胎发育率和成活率一直不理想，导致这种现象的原因比较复杂，其中胞内钙离子浓度的升高可能是发育率降低的一个重要原因。为了探究细胞内钙离子的改变对卵母细胞造成的影响，本研究通过透射电子显微镜、激光扫描共聚焦显微镜等对冷冻前后各组卵母细胞的超微结构、精子穿透、透明带消化、发育率以及钙离子浓度和波动进行研究。结果发现:
　　(1)透射电子显微镜下，新鲜对照组、毒胡萝卜素(Thapsigargin，TG)处理组、2-氨基乙氧基苯硼酸（2-Aminoethoxydiphenyl borate，2-APB）处理组卵母细胞的透明带和线粒体结构都比较完整;而冷冻组、TG冷冻组卵母细胞的冷冻损伤较严重，透明带变宽，边缘处破损，卵周隙变宽，线粒体结构模糊不清;2-APB冷冻组卵母细胞损伤较轻，透明带和线粒体等细胞器结构只有部分出现模糊。
　　(2)透明带消化时间和透明带结合精子个数:2-APB冷冻组(230.5±7.14，4.17±1.11)、TG冷冻组(172.5±5.91，1.17±1.03)、冷冻组(221.22±9.46，2.75±1.29)与新鲜对照组（300.14±7.45，8.00±2.45）相比透明带消化时间均显著降低、透明带结合精子个数也显著减少(P＜0.05);而2-APB冷冻组与TG冷冻组和冷冻组相比透明带消化时间显著升高、透明带结合精子个数也显著增加（P＜0.05）。
　　(3)从各组的发育率结果发现，冷冻组(59.39％)、TG处理组(71.91％)和TG冷冻组(52.29％)、2-APB处理组(85.71％)和2-APB冷冻组(66.39％)的卵裂率与新鲜对照组(79.45％)相比，均有显著性差异(P＜0.05);TG冷冻组(52.29％)的卵裂率与TG处理组(71.91％)相比，显著降低(P＜0.05);2-APB冷冻组(66.39％)与2-APB处理组(86.03％)卵裂率相比，显著降低（P＜0.05）。
　　(4)激光扫描共聚焦显微镜检测发现，各实验组的细胞内钙离子浓度，组间均有显著性差异(P＜0.05)，其中2-APB冷冻组（122.21±4.33）与TG冷冻组（146.87±7.49）、冷冻组（139.70±6.00）相比，细胞内钙离子浓度显著降低(P＜0.05)。检测细胞内钙离子的浓度波动发现，对照组钙离子一直保持动态稳定状态，处理组、TG组、2-APB组都明显地出现钙振荡，2-APB组钙震荡的峰值都明显低于另外两组，且整个钙震荡持续的时间也比另外两组短。
　　结果表明，TG会使胞内钙离子的浓度升高，使透明带硬化、破损程度更加严重，发育率降低;而使用2-APB处理冷冻卵母细胞能够一定程度上地降低胞内钙离子的浓度，使卵母细胞损伤程度降低，发育率升高，因此2-APB可被应用在细胞冷冻过程中降低冷冻对卵母细胞的损伤。

目录

声明

摘要

中英文缩写表 Abbreviations

第一章 玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞内钙离子研究概况

1．1 卵母细胞内钙离子的相关研究

1．1．1 钙离子的作用及存在形式

1．1．2 钙震荡

1．1．3 钙离子浓度的升高对卵母细胞的影响

1．1．4 钙离子调节剂对细胞内钙离子的影响

1．2 玻璃化冷冻对卵母细胞内钙离子的影响

1．2．1 卵母细胞的玻璃化冷冻对钙震荡的影响

1．2．2 玻璃化冷冻使卵母细胞内钙离子浓度升高的机制

1．3 本研究的意义

第二章 钙离子调节剂对玻璃化冷冻卵母细胞内钙离子的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验方法

2．1．3 试验设计

2．1．4 数据分析

2．2 结果与分析

2．2．1 钙离子调节剂对多卵母细胞内钙离子波动的影响

2．2．2 钙离子调节剂对冷冻卵母细胞内钙离子浓度的影响

2．3 讨论

第三章 胞内钙离子浓度对卵母细胞透明带冻融性损伤的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验方法

3．1．3 实验设计与统计分析

3．2 实验结果与分析

3．2．1 胞内钙离子浓度对玻璃化冷冻卵母细胞透明带消化时间的影响

3．2．2 胞内钙离子浓度对冷冻卵母细胞透明带精子穿透的影响

3．3 讨论

第四章 胞内钙离子浓度的改变对玻璃化冷冻卵子发育的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 卵母细胞内钙离子浓度改变对其发育率的影响

4．2．2 冷冻前后卵母细胞内钙离子浓度升高对各阶段发育率的影响

4．2．3 冷冻前后卵母细胞内钙离子浓度降低对各阶段发育率的影响

4．3 讨论

第五章 胞内钙离子浓度对冷冻小鼠卵母细胞超微结构的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 新鲜对照组卵母细胞超微结构

5．2．2 2-APB处理组卵母细胞超微结构

5．2．3 TG处理组卵母细胞超微结构

5．2．4 冷冻对照组卵母细胞的超微结构

5．2．5 TG冷冻组卵母细胞的超微结构

5．2．6 2-APB冷冻组卵母细胞超微结构

5．3 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

作者简介

攻读硕士学位期间发表论文情况