骨髓源性肝干细胞的筛选、扩增及诱导分化的研究肝癌术后肝再生状态与肝癌复发关系的初步研究

摘要

本文共分两部分：第一部分，骨髓源性肝干细胞的筛选、扩增及诱导分化的研究摘要肝炎、肝硬化及肝癌等肝脏疾病所致的终末性肝功能障碍，目前最有效的治疗手段是原位肝移植(OLT)。然而，由于供体匮乏、免疫排斥和高额费用等问题，原位肝移植的广泛应用受到了限制。肝细胞移植(HTx)和生物人工肝技术(BAL)是目前建立的替代治疗方式。与OLT相比，HTx和BAL具有操作简单、可重复进行、供肝细胞免疫源性较低且可冻存、移植失败或产生免疫排斥对受体影响小、治疗费用低等优点。理论上来讲，HTx和BAL在许多方面已经具有代替原位肝移植的潜在优势，但事实上，HTx和BAL的临床应用远未达到理论上的预期效果，存在一些亟待解决的问题，其中肝细胞来源缺乏是制约这两种治疗方式发展的重要因素。目前的研究方向有永生化肝细胞和肝干细胞。由于永生化肝细胞是由病毒致癌原转染而来，对机体有许多不确定的影响，目前尚未能对其应用进行评估。而干细胞由于具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能，为肝细胞移植及生物人工肝技术展示出诱人的前景。 肝干细胞的供源研究有肝源性的的肝干细胞(LSC)或肝祖细胞(HPC)以及非肝源性肝干细胞，前者包括卵圆细胞和小肝细胞，后者包括胚胎干细胞(ESC)、胰源性肝干细胞(PDLSC)和骨髓源性肝干细胞(BDLSC)。这些干细胞源，均已证实具有向肝实质细胞分化的潜能，但各有其优缺点。从细胞特征、供体来源以及分离培养的特点等方面看，BDLSC具有易于调控、供源丰富、容易获得、可从自体获取、避免免疫排斥等优点，是较为理想的肝干细胞来源。 BDLSC的研究，目前只是证实了它的存在以及转化能力，还不能进入应用研究阶段，原因之一在于骨髓内的细胞群体非常复杂，至今尚未发现可直接鉴定BDLSC的特征性表面标志，其在骨髓干细胞衍生过程中的具体谱系定位也不清楚，以至对其的分离纯化存在困难。目前鉴别BDLSC的研究方法，需要分析新的原始细胞标志或者新的干细胞群体，尽管有利于对骨髓内细胞群体的精确划分，却导致了对肝干细胞识别和分离的困难，而且实用性不强。 鉴于成体干细胞的增殖需要环境刺激的特征，肝干细胞的增殖需要肝再生的微环境，而我们的前期工作发现适合肝干细胞增殖的肝损伤病理微环境是其它骨髓细胞类型所不能适应的，由此本课题设想采用适者生存的原理，建立一套病理微环境的体外筛选培养体系，在这一培养体系中，只有适应这一环境的肝干细胞可以生存增殖，而其它类型的细胞则逐渐凋亡，从而达到从骨髓细胞的体外培养中直接筛选和扩增肝干细胞的目的，并进行体内外诱导分化，探讨临床应用的可行性。 结论：1.大鼠筛选培养液以含5％淤胆血清的最佳，一方面可以使适应该病理微环境的BDLSC能够生长分化，另一方面使不能适应的非肝干细胞凋亡，达到筛选与纯化的目的。扩增培养体系可以将纯化的肝干细胞培养传代至8代，8代以后细胞出现纤维样细胞的增生。流式细胞仪检测肝干细胞表面标志，各代细胞稳定表达各干细胞标志，说明传代的稳定性。分化的细胞具有肝细胞样表型和功能：表达白蛋白、AFP、CK8/18；有肝细胞特征蛋白的mRNA转录；呈现与肝细胞相似的超微结构；具有糖原和尿素合成的功能；经门静脉及经脾移植均可整合入肝板，脾脏内也可见肝细胞样细胞的增殖。 2.人骨髓肝干细胞的筛选采用急性肝功能不全的血清，TBIL在150μmol/L～300μmol/L，HGF浓度在10～20ng/ml，以5％浓度加入基础培养液筛选效果最为理想。扩增培养液可将肝干细胞传代达5代。流式细胞仪检测肝干细胞的表面标志与肝卵圆细胞的标志相似。分化细胞具有肝细胞样的表型和功能：免疫荧光表达白蛋白；有肝细胞特征性蛋白的mRNA转录；Westernblot检测分化前后白蛋白、AFP表达有差异，分化前白蛋白低表达、AFP高表达，分化后则相反；分化细胞具有尿素及白蛋白合成功能。 [结论]1.含淤胆血清的病理筛选培养体系可以筛选、纯化大鼠骨髓肝干细胞，扩增培养体系可将大鼠肝干细胞培养传代达8代，分化培养体系可以诱导肝干细胞分化成具有肝细胞样表型及功能的肝细胞样细胞，经门静脉及脾脏均可进行细胞移植，脾内环境也适合移植细胞的生长。 2.采用人急性肝功能不全的病理血清可以筛选、纯化人骨髓肝干细胞，获得纯化的肝干细胞后进行扩增培养目前可获得肝干细胞传代5代，具有与肝卵圆细胞相似的细胞表面标志，诱导分化后具有肝细胞样的表型特征及功能。 第二部分，肝癌术后肝再生状态与肝癌复发关系的初步研究摘要原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，由于多数合并肝硬化并且难于早期诊断，预后极差。肝癌的治疗，目前最有效的方法是手术治疗，然而术后肿瘤的复发和转移仍严重影响患者的生存率。近年来，对肝癌复发的危险因素进行了广泛的研究，肿瘤的生物学特性是目前研究的重点。肿瘤生物学特性也是多方面的，包括肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤包膜完整性、门静脉癌栓、肿瘤的分化程度、p53基因突变、癌周组织的雄激素受体以及癌细胞DNA倍体情况等多个因素，至今尚缺乏判断肝癌术后预后有效的指标。 我们注意到，肿瘤细胞的生长取决于肿瘤细胞本身的特性及肿瘤细胞所处的环境。肝切除后肝脏即进入增殖状态，引起一系列肝再生因子水平的变化，这些因子一方面使肝再生精确、有序地进行，另一方面也有可能影响肿瘤细胞所处的环境，导致肿瘤的复发。其中，肝细胞生长因子是肝细胞最强烈的增殖刺激因子和促有丝分裂原，与肿瘤细胞的生长、浸润及转移关系密切。 结论：1.肝切除后，患者血清HGF水平升高，术后10天左右出现高峰期，14天HGF水平开始降低。大肝癌患者的升高水平明显高于小肝癌患者，而TAE患者术后略为增高，手术患者的HGF水平与TAE患者相比各时段均有显著意义(p＜0.05) 2.RT-PCR结果显示，术后不同复发时段肝癌组织均存在c-metmRNA的转录，且半定量结果显示均比癌旁组织高，复发时间越短，转录水平越高；WesternBlot结果从蛋白水平证明复发时间早的患者其c-met蛋白的表达水平高，与病理结果相比较，复发时间早的患者病理恶性程度高。 3.根据以上结果，肝癌细胞表达c-met蛋白的水平可能反映肿瘤的恶性程度，与术后复发有一定的关系，从而可评估手术的预后；针对术后肝再生期对肝癌患者进行抑制肿瘤细胞增殖治疗或者阻断激素受体的治疗可能会改善肝癌患者术后的预后；术前检测肝再生因子的受体水平可能可以指导肝癌治疗方式的选择。 4.本文对肝癌术后肝再生激素水平的变化及肝癌细胞的激素受体进行了初步的研究，虽然病例数少，但对今后的研究也有一定的指导意义，进一步的研究将有可能获得更准确的结论，从而为临床治疗决策提供参考。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写对照

第一篇：骨髓源性肝干细胞的筛选、扩增及诱导分化的研究

引言

实验主要材料、试剂和配方

第一章：大鼠骨髓源性肝干细胞的筛选、扩增及体内外诱导分化的研究

材料与方法

结果

讨论

小结

第二章：人骨髓肝干细胞的筛选、扩增及诱导分化的研究

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二篇：肝癌术后肝再生状态与肝癌复发关系的初步研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附图

第一篇

第一章1

第一章2

第二章

第二篇

附件

一、个人简历

二、学术论文发表情况

三、在站期间获得的科研资金及承担的其它课题

四、在站期间参加国内外学术会议情况

五、在站期间承担教学和/或工作情况

致谢