四逆汤对兔髂动脉球囊损伤后血管狭窄的作用及机制研究

摘要

自首例经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)获得成功以来，随着临床经验的不断积累，操作技术的提高以及气囊导管和造影设备的不断改进，PTCA的成功率显著提高。然而PTCA后冠状动脉早期再狭窄(RS)的发生率多年来无明显降低，高达25％～35％，少数达50％，已成为影响其治疗效果的主要因素，也是近年来临床和实验室研究极为关注的课题。 人类PTCA术后RS病变的发生过程中，血管内膜增殖和血管重塑起着非常重要的作用，另外血栓形成、炎性反应、免疫反应和感染等因素也起着一定的作用，还与许多细胞因子、生长因子、血管和血细胞成分相互作用有关。一般认为，RS过程是一个血管损伤后新生内膜增生与血管重构的过程。 转化生长因子-β1(TGF-β1)是调节平滑肌细胞增殖、迁移和细胞外基质(ECM)分泌，促进外膜成纤维细胞的增殖、迁移和表型转化重要因子，TGF-β1参与血管损伤后内膜增殖和负性血管重塑，在PTCA术后RS病理过程中起到重要作用。 一氧化氮(NO)是由正常内皮细胞NO合酶(NOS)以L-精氨酸(L-Arg)为底物合成和释放的舒张因子，内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达，NO的持续释放，能减少基础和刺激后平滑肌细胞(SMC)的迁移，在多个环节抑制RS的形成。 氧化应激对血管损伤后的RS起重要作用，抑制氧化应激可能对血管损伤后的RS起抑制作用。 应用阿司匹林、普通肝素、低分子肝素等药物治疗PTCA后RS均无明显疗效，而血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂、他汀类药物等效果也不尽如人意，冠脉内放置支架在一定程度预防了术后RS，但本身作为异物，可致血栓形成和异物反应。涂层支架仍有许多问题需要解决如价格昂贵难以大规模推广，基因治疗尚有许多理论、技术、伦理等方面的问题需要解决，短时间内难以大规模应用于临床，因此寻找一种能够有效防治PTCA术后RS的药物是目前冠脉介入治疗的当务之急。 四逆汤(SND)出自《伤寒论》，由附子、干姜、甘草三味药组成，现代大量动物和药理实验证实四逆汤具有抗氧化应激、保护血管内皮细胞功能、改善冠脉循环、抗实验性动脉粥样硬化等多种作用，我们推测其可能在防治PTCA术后RS方面起重要作用。 本课题的目的是通过球囊损伤兔髂动脉造成动脉损伤的动物模型，观察中药四逆汤对损伤后动脉内膜的保护和修复作用，以及对TGF-β1和NO系统的影响，探讨四逆汤对兔髂动脉球囊损伤后狭窄的防治作用及其可能机制，为四逆汤用于临床防治PTCA术后RS提供理论依据。 材料与方法 雄性新西兰大白兔24只，兔龄4月，体重2.56±0.24Kg，随机分为对照组、模型组、四逆汤治疗组(四逆汤组)，每组8只，对照组兔予普通饲料，模型组、四逆汤组兔予以高脂饮食(胆固醇1.0％，猪油10％，余为普通饲料)。饲养2周后模型组、四逆汤组兔行髂动脉内膜剥脱术，对照组兔行假手术。术后四周处死各组实验兔，留取血清检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、TGF-β1、NO、NOS水平；剪取球囊损伤侧髂动脉，经中性甲醛固定后分别行HE染色观察血管内膜增生情况，通过免疫组化检查观察TGFβ-1和eNOS蛋白在血管壁的表达，图像分析仪分析染色结果；留取部分髂动脉通过透射电镜观察髂动脉的超微结构的变化，扫描电镜观察内皮细胞排列和结构；留取部分髂动脉采用RT-PCR方法检测血管壁TGF-β1和eNOSmRNA的表达。 结果 对照组兔于喂养14天时自然死亡1只，模型组兔于术后第10天死亡1只，四逆汤组兔于术后第2天死亡1只。所以，实验结束时每组各有动物7只。 1、四逆汤对兔髂动脉形态学的影响：扫描电镜结果发现，对照组兔髂动脉内膜的内皮细胞形态正常，排列整齐；而模型组兔髂动脉可见内皮细胞脱落，内皮细胞增生形态各异，内皮下胶原纤维暴露；而四逆汤组内皮细胞排列基本正常； 透射电镜发现，对照组兔髂动脉血管壁结构层次清晰，内皮完整，无泡沫细胞；模型组可见内皮细胞脱落，大量泡沫细胞，平滑肌细胞游走；四逆汤组内皮细胞基本正常，泡沫细胞较少； 光镜结果发现，对照组兔髂动脉管腔和管壁厚度正常，管壁光滑；模型组与对照组相比，管壁明显增厚、管腔明显狭窄，内膜增厚，可见巨大动脉硬化斑；而治疗组管壁增厚较轻，管腔狭窄较轻，内膜增厚程度减轻；图象分析结果发现：模型组兔髂动脉内膜厚度明显大于四逆汤组和对照组(P＜0.05)，模型组兔髂动脉管腔面积明显小于四逆汤组和对照组(P＜0.05)。 结果显示四逆汤具有促进血管损伤后的修复，抑制动脉粥样硬化的发展，防止血管狭窄的作用。 2、四逆汤对兔血清脂质的影响：四逆汤组兔血清TC、TG和LDL-C明显高于对照组，但是低于模型组，而且四逆汤组兔血清HDL-C明显高于对照组和模型组，说明四逆汤可有效的调节血脂。 3、四逆汤对兔血清SOD活性和MDA水平的影响：对照组兔血清SOD活性明显高于四逆汤组和模型组，治疗组SOD活性又明显高于模型组(P＜0.05)。而对照组兔血清MDA水平明显低于四逆汤组和模型组，四逆汤组MDA水平又明显低于模型组(P＜0.05)。结果提示四逆汤可提高SOD的活性，抑制脂质过氧化反应。 4、四逆汤对兔TGF-β1的影响：对照组兔血清TGF-β1水平明显低于模型组和四逆汤组，四逆汤组又明显低于模型组(P＜0.05)。免疫组化结果发现对照组兔髂动脉内膜TGF-β1的分布稀疏，而模型组TGFβ-1的染色面积明显大于对照组(P＜0.05)，四逆汤组TGF-β1的染色面积明显小于模型组(P＜0.05)。模型组TGF-β1的染色灰度明显大于对照组(P＜0.05)，四逆汤组TGF-β1的染色灰度明显小于模型组(P＜0.05)。RT-PCR结果显示在对照组兔髂动脉有少量TGF-β1mRNA表达，模型组TGF-β1mRNA表达明显增加，而四逆汤组TGF-β1mRNA的表达比模型组明显减少，与模型组有显著性差异(P＜0.05)。 5、四逆汤对兔NO系统的影响：本研究结果发现模型组兔血清NO水平明显低于对照组和四逆汤组，P＜0.05；四逆汤组与对照组相比无显著性差异，P＞0.05；模型组兔血清总NOS活性明显低于对照组和四逆汤组，P＜0.05；四逆汤组与对照组相比无显著性差异，P＞0.05；免疫组化示三组动物内膜均有eNOs蛋白表达，模型组eNOs和四逆汤组蛋白表达较对照组明显减弱(P＜0.05)，四逆汤组eNOs蛋白表达比模型组明显增强(P＜0.05)。三组动物内膜内有eNOSmRNA表达，模型组和四逆汤组eNOSmRNA表达较对照组明显减弱(P＜0.05)，四逆汤组较模型组明显增强(P＜0.05)。 结论 1.四逆汤可减轻兔髂动脉剥脱术后的内膜增生和血管的狭窄； 2.四逆汤对高脂饮食兔具有抗动脉粥样硬化作用。 3.四逆汤可抑制髂动脉剥脱术后兔的脂质过氧化反应，增强SOD的活性。 4.四逆汤可抑制髂动脉损伤后内皮TGF-β1的基因和蛋白的表达，减少TGF-β1的产生。 5.四逆汤可促进髂动脉损伤后内膜eNOS的蛋白和基因的表达，增加NO的产生。

目录

文摘

英文文摘

第一章前言

第二章材料与方法

第三章结果

第四章讨论

第五章结论

参考文献

附录

致谢

原创性声明