携带截短型SARS-CoV刺突蛋白S1亚单位重组腺病毒在大鼠体内诱导的抗SARS-CoV免疫反应研究

摘要

研究背景和研究目的：严重急性的呼吸道综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)是一种由SARS病毒感染引起的突发性致命性疾病。发展有效而安全的SARS病毒疫苗是控制和预防SARS再次爆发的最好方法。SARS病毒灭活疫苗是最易制备的SARS疫苗，但灭活的全病毒疫苗存在着一些不安全的因素。研制SARS基因疫苗可能是一种更好的选择。 S蛋白是SARS病毒的主要结构蛋白，由S1和S2两个亚单位构成。Sl负责识别和结合宿主细胞表面的受体，而S2介导病毒与细胞膜融合。采用可溶性SARS病毒受体或抗S1抗体均能通过干扰其与细胞受体的结合而阻断病毒的有效感染。根据上述事实可以提出一个假设：如果设计一个疫苗干扰S蛋白与其受体的结合，那就可以阻止SARS病毒经受体结合途径传播。非人类冠状病毒疫苗的研究已证实冠状病毒S1亚单位上存在诱导产生中和抗体的抗原表位，它诱导产生的中和抗体能保护动物免受相应病毒的感染。最近关于SARS病毒疫苗的研究也证实表达S蛋白或其S1亚单位的基因疫苗能在多种动物模型中诱导高滴度的保护性中和抗体产生。然而Weingartl等报道用痘苗病毒表达全长S蛋白可在雪貂体内快速诱导出有效的中和抗体反应，同时也增强了SARS病毒诱导的肝脏炎症反应。 在本研究中，我们构建一个表达截短的S1亚单位片段(截短的S1亚单位，SN)的重组5型腺病毒Ad-S<,N>，研究其在大鼠体内诱导的体液和细胞免疫反应，同时进行初步的安全性研究，希望能为研制出一种安全、有效的SARS病毒疫苗打好基础。 实验方法: 1.重组腺病毒的构建 通过PCR扩增SARS病毒(SARS-CoV)刺突蛋白(Spike)N端基因片段(SN，-45nt～1469nt)。引物分别为5’-GGTCTAGAGTlTGTGGTTFCAAGTGAT-3’和5’-TAGGTACCAATGCCAGTAGTGGTG-3’。S<,N>片段通过．XbaI和KpnI位点克隆进pShuttle质粒得到pShuttle-S<,N>。所得质粒采用PCR、限制性酶切和测序分析进行鉴定。 将pShuttle-S<,N>用I-CeuI和PI-SCeI酶切后，与pAdeno-X的I-CeuI/PI-SceI双酶切片段直接连接，构建含SN表达框的重组腺病毒质粒pAd-S<,N>。构建产物采用PCR法初步鉴定后，再用限制性酶切分析和测序鉴定。将pAd-S<,N>用PacI酶切使重组腺病毒DNA线性化后转染至293细胞以获得重组腺病毒Ad-S<,N>。重组腺病毒在293细胞中扩增，经CsCl密度梯度离心纯化后，采用Adeno-X<'TM>快速滴度测定试剂盒测定滴度。通过PCR检测S<,N>表达框架、重组腺病毒骨架(E2区)对重组腺病毒进行鉴定，并检测其中有无野生型腺病毒、无表达框架或无外源基因的重组腺病毒、腺相关病毒污染。通过限制性酶切分析鉴定Ad-S<,N>基因组的正确性。 Ad-Lacz和Ad-GFP分别为携带β-半乳糖苷酶基因和绿色荧光蛋白基因的重组5型腺病毒，是本实验室按照同样方法构建的，在本研究中作为载体对照。 2.RT-PCR检测S<,N>基因表达 用TRIZOL试剂抽提重组腺病毒感染的Vero-E6细胞或大鼠组织中的RNA，用无Rnase的DNase去除残留的DNA后，将其反转录为cDNA，然后用SN特异的引物(5’-CGAGTACATATCTGATGCC-3’和5’-ACGCCATAGCACTTAAAGG-3’)进行PCR检测S<,N> mRNA水平的表达，内对照采用β-actin引物(5’-CGTCTCCCCTCCATCGTG-3’和5’-CCCTCATAGATGGGCACAG-3’)。 3.Western blot分析 为了检测S<,N>的表达及S<,N>与SARS患者血清和免疫大鼠抗血清的特异性结合反应，我们采用三种一抗：兔抗SARS刺突蛋白IgG、SARS患者康复期血清、免疫大鼠血清进行了Western blot分析。细胞裂解液、细胞培养上清和大鼠组织匀浆液用10﹪ SDS-PAGE分离、转移至PVDF膜上；PVDF膜封闭过夜后，依次与一抗(兔抗SARS刺突蛋白IgG、SARS患者康复期血清、免疫大鼠血清)、二抗(HRP偶联的抗兔/人/大鼠IgG抗体)杂交，用LumiGLO<'TM>显色液显色(化学发光)，X光片曝光显影。 4.免疫大鼠 Wistar大鼠(每组10只)分别用Ad-S<,N>(1×10<'7>pfu/(dose·rat))或对照(Ad-LacZ或PBS)通过鼻腔(i.n.)或皮下(S.C.)免疫大鼠，大鼠分别于第0、7、14天各免疫一次，于第0、7、14和21天通过眼窝静脉丛取血；第28天从腹主静脉取血，并处死动物，取各主要组织和器官。 5.抗SARS-CoV抗体检测 抗SARS-CoV IgG滴度用ELIsA法测定。SARS-CoV全抗原包被的96孔酶标板依次用2倍系列稀释的大鼠血清、HRP偶联的抗大鼠IgG抗体(二抗)孵育，加底物液显色，用酶标仪测450nm吸光度OD<,450nm>(630nm作为对照波长)；OD<,450nm>值高于阴性对照0.16的孔定位阳性，样品阳性孔最高稀释度为抗体的滴度。 6.抗SARS-CoV中和抗体检测 免疫大鼠血清中和抗体活性用体外微孔中和分析法测定。2倍系列稀释的热灭活大鼠血清与100TCID50的SARS病毒混合后温育1h后，加入种有Vero．E6细胞的96孔板中37℃培养3～4天，观察细胞病变情况；每组实验孔中60﹪以上(即5复孔中至少3个孔)细胞不出现病变的血清最高稀释度为该样品的中和抗体滴度。 7.大鼠CTL活性检测 免疫大鼠脾细胞匀浆、过滤、梯度离心、过尼龙毛柱获得大鼠T细胞，用SARS病毒S蛋白抗原肽库刺激48h后作为效应细胞，靶细胞为大鼠肝细胞BRL-pcDNA3.1(S<'->)和BRL-sarsS(S<'+>)，用乳酸脱氢酶释放法检测大鼠T细胞的杀伤效应。设置效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、体积校正对照孔、培养基背景孔等对照。测量490nm处的光吸收(OD)值，按以下公式计算杀伤活性。杀伤活性(﹪)=[(OD<,杀伤孔>-OD<,培养基背景>)-(OD<,效应细胞自发释放>-OD<,培养基背景>)-(OD<,靶细胞自发释放>-OD<,培养基背景>)]/[(OD<,靶细胞最大释放>-OD体积校正)-(OD<,靶细胞自发释放>-OD<,培养基背景>)]×100 8.实验大鼠组织学检查 免疫大鼠于第28天处死，取各种主要脏器和组织(肺、肝、结肠、心脏、脑组织、脾脏、肾脏等)，用含10﹪福尔马林的PBS固定，然后用石蜡包埋切片，HE染色。于显微镜下观察组织细胞形态和结构。 结论: 腺病毒载体携带截短的SARS病毒刺突蛋白S1亚单位(SN)在大鼠体内表达，能有效诱导特异性体液和细胞免疫反应。通过鼻腔免疫(诱导粘膜免疫的方式)能得到和皮下免疫相近的体液免疫反应，但其诱导的细胞免疫反应弱于皮下给药。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

1.1实验材料和仪器

1.2实验步骤和方法

1.3实验结果

1.3.1SARS病毒S蛋白N端片段抗原性分析

1.3.2PCR扩增SARS病毒S蛋白N端基因片段

1.3.3SAES-Cov Spike SN片段的克隆

1.3.4克隆的SN片段表达蛋白抗原性分析

1.3.5重组腺病毒质粒pAd-SN构建

1.3.6重组腺病毒Ad-SN的包装、鉴定、扩增、纯化和滴度测定

1.4讨论

1.5小结

第二部分重组腺病毒Ad-SN在体内外表达研究

2.1实验材料和仪器

2.2实验方法和步骤

2.3实验结果

2.4讨论

2.5小结

第三部分Ad-SN诱导抗SARS病毒免疫反应研究

3.1实验材料和仪器

3.2实验方法和步骤

3.3实验结果

3.4讨论

3.5小结

总结与展望

参考文献

附录一：测序图

附录BJ01 SN片段和克隆的SN片段抗原性分析比较

附录三论文中使用缩略词

附录四攻读博士学位期间主要研究成果

致谢

论文原创性声明