文昌鱼的免疫系统比较基因组学分析及其TLR和TNF信号通路的研究

摘要

头索动物文昌鱼是除尾索动物外与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物，加之它具有一个没有经历大规模基因复制和基因丢失的基因组，因此是研究脊椎动物起源和演化的重要参考物种。脊椎动物免疫系统特别是适应性免疫系统的起源是近年免疫学界关注的热点，本论文以文昌鱼的免疫系统为研究对象，尝试通过比较免疫免疫学分析等手段来探索未知的免疫机制、揭示脊椎动物免疫系统的起源。 本研究利用美国文昌鱼(Branchiostoma floridae)的基因组草图对文昌鱼的免疫相关基因进行全面分析，第一次从基因组水平上刻画了文昌鱼的免疫系统。文昌鱼中将近1/12的基因模型(gene model)与免疫系统有关，其中包括数千个免疫受体模型、近千个免疫信号传导基因模型。文昌鱼拥有数十个Toll-like受体、NLR受体和清除剂受体，虽然与棘皮动物海胆中动辄200多个该类受体有一定差距，但是已经数倍于有颌类脊椎动物的同类免疫受体。文昌鱼基因组还编码了近200个LRRIG受体基因、数百个LRR-only受体基因和数百个C型凝集素蛋白基因，在其它已知动物基因组中还没有发现同类基因有如此巨大的数目扩增。此外，文昌鱼还具有基于免疫球蛋白可变结构域(IgV)的高度多样化免疫受体家族VCBP，还有与脊椎动物T细胞受体结构相似的膜表面受体VCP。综合海胆基因组的类似情况，我们推测在缺少现代脊椎动物的适应性免疫系统的原始脊索动物中，种系编码大规模多类型的免疫识别受体是它们通用的免疫识别机制。 除了免疫受体外，文昌鱼免疫信号系统的中间信号传导基因也经历了大规模的基因扩增，这包括24个TRAF接头蛋白家族、57个带有TIR结构域的蛋白、数百个带有死亡相关结构域的蛋白以及33个负责启动凋亡的caspase基因。 除了数量上的增加，我们还发现文昌鱼中无论是受体还是中间信号分子，均包含大量新颖的蛋白架构(或者蛋白结构域组合)，我们推测文昌鱼可能通过动态的结构域重排(domain resuffiing)来不断产生新的蛋白架构。 包括海胆和海鞘在内的无脊椎动物，其TNF-TNFR信号系统都非常简单。而文昌鱼具有24个肿瘤坏死因子(TNF)和36个TNF受体(TNFR)，构成了一个复杂程度不亚于脊椎动物的却又不失自身特色的TNF-TNFR信号系统。我们推测文昌鱼和脊椎动物TNF系统的发展可能由相同的选择压力所驱动，即宿主防御系统对信号调节的需求。尽管没有在文昌鱼中找到诸如抗体、T细胞受体、MHC分子等脊椎动物适应免疫的标志性分子，但是那些在脊椎动物中参与体细胞重排的重要基因如RIG1、TdT等，在文昌鱼中均有同源基因存在，此外还存在protoMHC区域和染色体重组热点(如VCBP基因座)，这些发现显示脊椎动物适应性免疫系统的基本元素在早期脊索动物中已经具备。 综上所述，文昌鱼免疫系统最大的特点是：种系编码(对应于体细胞重排)的多样性几乎渗透到文昌鱼免疫系统的每一个方面，无论是免疫识别受体方面还是免疫信号中间传递分子方面，无论是基因数量方面还是蛋白结构种类方面。 Foil-like受体(TLR)是天然免疫中非常重要的一类跨膜免疫识别受体，文昌鱼拥有至少48个TLR，约是人类的5倍，而脊椎动物中主要的TIR接头蛋白如MyD88和TRAM在文昌鱼中都有发现，提示文昌鱼具有类似的TLR信号通路。我们从青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtauense中克隆到1个TLR(bbtTLR1)和1个TIR接头蛋白(bbtMyD88)，研究显示bbtTLR1应当具有保守的免疫功能，而且和bbtMyD88一起构成了一条保守的信号传递途径。 前面提到文昌鱼具有发达的TNF-TNFR信号系统，我们从青岛文昌鱼中克隆到4个TNF基因，包括3个bbtTRAIL和1个bbtEDA1，还有2个TNFR，即bbtDR1和bbtEDAR。初步分析显示这些基因与脊椎动物的同源基因有相似的表达谱，暗示可能具有类似的功能机制。 在免疫反应中，有一类小型的四次跨膜蛋白即tetraspanin，能够以分子组织者的身份组织各种免疫相关蛋白在膜上形成所谓的功能微结构域(如免疫突触等)，从而调节这些蛋白的功能行使。因此tetraspanin虽然不直接参与免疫反应，却对正常免疫反应有不可忽视的影响。我们对克隆自青岛文昌鱼的12条tetraspanin序列以及从网上数据库收集到的序列进行系统分析，第一次完整地描述了tetraspanin家族的起源和演化过程。我们提出该基因家族存在于阿米巴变形虫和所有多细胞动植物中，最初参与细胞膜的动态形变，之后成为胞间相互作用中的重要分子组织者。 由于具有重要的进化地位，文昌鱼在比较生理学、比较发育学和比较免疫学中都具有重要的研究价值，但要发挥它的研究价值需要多种生物学技术的配合。为了方便在文昌鱼上进行免疫学的功能比较研究，我们尝试分离和培养文昌鱼的原代细胞，目前已经积累了一定的经验。

目录

摘要

第1章 绪论

1文昌鱼概况

2文昌鱼的分子进化生物学研究

3文昌鱼的发育生物学研究

4文昌鱼的比较免疫学研究

5文昌鱼的作为实验模型的开发进展

6本论文研究目的和意义

7本论文研究的创新点

第2章 文昌鱼的免疫系统比较基因组学分析

1前言

2材料与方法

3结果与分析

3.1基因组草图的概貌和基因数目的预测问题

3.2文昌鱼免疫系统概况

3.3 TLR免疫识别受体

3.4 NLR免疫识别受体

3.5 LRRIG受体

3.6仅含有LRR的基因(LRR-only)

3.7 C型凝集素

3.8清除剂受体、RIG-like解旋酶和其它免疫识别分子

3.9补体系统

3.10 TNF/TNFR信号通路系统

3.11带有死亡相关结构域的信号传递分子

3.12 TIR结构域接头蛋白、TRAF蛋白和凋亡启动类caspase

3.13细胞因子和转录因子

3.14适应性免疫

4补充材料

5讨论与结论

5.1免疫识别受体的多样性和演化

5.2中间信号传导分子的多样性

5.3蛋白质结构的多样性和动态变化

5.4结论

6小结和展望

第3章 bbtTLR1和bbtMyD88基因的克隆和功能研究

1前言

2材料与方法

3结果与分析

3.1 bbtTLR1的克隆和序列分析

3.2 bbtMyD88 cDNA编码区的克隆

3.3 bbtTLR1的southern blot分析

3.4 bbtTLR1的基因组结构及其LRR区域的多态性分析

3.5 bbtTLR1的进化分析

3.6 bbtTLR1的启动子分析

3.7 bbtTLR1在胚胎发育期和成体的表达谱分析

3.8 bbtTLR1在病原物刺激之下的表达谱分析

4补充材料

5讨论

6小结和展望

第4章 文昌鱼TNF和TNFR相关基因的克隆和表达谱分析

第5章Tetraspanin基因家族的起源和进化分析

1前言

2材料与方法

3结果与分析

3.1tetraspanin的起源

3.2高度分化的线虫tetrapsnanin和血吸虫tetrapsnanin

3.3果蝇是否具有过多的tetrapsnanin基因?

3.4脊椎动物tetraspanin的系统进化分析

4讨论

4.1EC2结构的初次演化和二次演化

4.2 tetraspanin成员的增殖和相应的功能冗余问题

4.3早期tetraspanin的功能

4.4 tetraspanin与细胞-细胞之间或基质-细胞间相互作用的共进化

5小结和展望

第6章 文昌鱼原代细胞培养的初步探索

1前言

2材料与方法

3结果与分析

3.1文昌鱼体内渗透压的测定

3.2文昌鱼成体原代细胞培养的基本方法

3.3成体原代细胞培养的初步结果

3.4胚胎原代细胞培养的初步尝试

4讨论

5小结与展望

总结与展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及参与的主要研究课题

附录

致谢

论文原创性声明