丛枝菌根真菌Gigaspora margarita孢子伴生细菌的种群特征及生物学效应分析

摘要

本文主要以Gigaspora margarita MAFF 520054为材料，对其孢子表面和内部的细菌种群作了系统研究，并对伴生细菌的生物学效应作了相应的分析。 1.孢子伴生细菌的种群分析扫描电镜观察，发现G margarita的孢子表面黏附有多种形态的细菌状物。以不同的扩繁条件(基质及宿主植物)对G margarita进行繁孢，并通过分离鉴定途径分析了新形成孢子的伴生细菌种群组成。以TSA或高氏1号培养基进行好氧或厌氧分离，结果表明，各种来源的G margarita的伴生细菌在数量和种群分布上存在明显的差异，数量范围为25-100 CFU／孢子。根据菌落形态上的差异，获得66株细菌，通过形态、部分生理生化以及16S rDNA序列分析，鉴定出其中63个菌株分别属于3个分类门(Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes)共27个分类属。通过比较各类细菌出现的频率和数量，发现Bacillus、Ralstonia、Paenibacillus和Streptomyces是其中的常见或优势类群，且放线菌类群是G margarita伴生细菌的重要类群。 以砂／土为基质、烟草(Nicotiana tabacum L．)为宿主，分别对G margarita和Gigaspora rosea JP1的进行繁殖产孢；以烟草或紫花苜蓿(Medicago sativa L．)为宿主，砂／土或蛭石为基质对G margarita进行繁殖产孢。以细菌16S rDNA V3区为目标区域，PCR-DGGE技术分析新形成孢子的伴生细菌种群，以及相应的砂土基质中细菌种群。DGGE图谱的聚类分析表明，两种AMF孢子表面的细菌种群与对应的繁孢砂土基质中的细菌种群具有明显差异，且G margarita和G rosea的伴生细菌种群也存在明显差异；4种培养条件下获得的G. margarita孢子，其伴生细菌种群相互之间存在明显的差异。可以认为，AMF孢子是土壤细菌特殊的生态位点，AMF的伴生细菌种群结构受到真菌菌种的影响，同时也受到宿主植物和基质的影响。进一步对主要的DGGE条带进行序列分析。结果表明，Proteobacteria门的Rubrivivax、Azospirillum、Azovibrio、Rhizobium，以及Actinobacteria门的streptomyces、Amycolatopsis、Pseudonocardia类群是G margarita孢子伴生细菌的优势种群。以PCR-DGGE技术，分析了G margarita孢子破碎前后的细菌种群结构变化。结果表明，孢子破碎后其DGGE图谱发生明显的变化，表现为两条主要的条带，分别记为7A、7B。测序和BLAST分析，7B与已报道的G margarita细胞质内生细菌“Candidatus Glomeribacter Gigasporarumn

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章、文献综述

1.1丛枝菌根真菌的研究概况

1.1.1概念及生物学特征

1.1.2生理与生态功能

1.1.3应用前景分析

1.2丛枝菌根真菌伴生细菌的研究进展

1.2.1伴生细菌的存在状况

1.2.2伴生细菌的生物学效应

1.2.3展望

引言

第二章、伴生细菌的原位观察、分离及鉴定

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2 AMF孢子的准备

2.1.3伴生细菌的原位观察

2.1.4伴生细菌的分离

2.1.5菌株的鉴定

2.2结果与分析

2.2.1伴生细菌的原位观察

2.2.2伴生细菌的分离与鉴定

2.3结论与讨论

第三章、PCR-DGGE分析伴生细菌种群组成

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2试验设计

3.1.3靶DNA的提取

3.1.4 16S rDNA V3区的扩增

3.1.5 DGGE分析

3.1.6切胶测序

3.1.7 DGGE图谱的聚类分析

3.2结果与分析

3.2.1 DNA提取与PCR扩增

3.2.2 DGGE分析

3.2.3优势菌群的测序鉴定

3.3结论与讨论

第四章、伴生细菌7A的发现与分析

4.1材料与方法

4.1.1生物材料

4.1.2靶DNA提取

4.1.3 PCR扩增

4.1.4 DGGE和克隆测序

4.1.5目标菌16S rDNA序列的扩增

4.1.6无杂菌G margarita孢子的7A检测

4.1.7透射电镜观察

4.1.8 7A分布的检测

4.1.9 7A的分离培养试验

4.2结果与分析

4.2.1一种新的细菌序列7A与G.margarita孢子紧密相关

4.2.2 16S rDNA的扩增与序列分析

4.2.3 7A存在于无杂菌G.margarita孢子中

4.2.4 7A的分布

4.2.5 G.margarita孢子的TEM观察

4.2.6 7A的分离试验

4.3结论与讨论

第五章、伴生细菌的生物学效应分析

5.1材料与方法

5.1.1试验材料

5.1.2菌群效应的分析

5.1.3伴生细菌菌株效应的分析

5.2结果与分析

5.2.1伴生菌群对AMF及植物的影响

5.2.2伴生细菌的种群分析

5.2.3对孢子萌发的影响

5.2.4对菌丝生长的影响

5.2.5盆栽条件下生物效应的测定

5.2.6解磷、几丁质降解及抑菌活性测定

5.3结论与讨论

第六章、伴生细菌的GFP标记及定殖研究

6.1材料与方法

6.1.1试验材料

6.1.2目标菌株的GFP标记

6.1.3 GFP标记株的定殖试验

6.2结果与分析

6.2.1电转化及转化子筛选、鉴定

6.2.2标记株的质粒稳定性测定

6.2.3标记株与原始株的性状比较

6.2.4标记株对G.margarita孢子和菌丝的定殖

6.2.5不同pH值下标记株的定殖动态

6.2.6不同活力孢子的标记株定殖动态

6.2.7盆栽条件下菌株的定殖分布

6.3结论与讨论

全文结语

参考文献

附录

致谢